4种冬虫夏草总RNA提取方法的比较

2012-08-09陈国梁贺晓龙陈宗礼任桂梅梁倩男

长江蔬菜 2012年2期

陈国梁，贺晓龙，陈宗礼，任桂梅，梁倩男

（延安大学生命科学学院/陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，716000）

提取纯度高、完整性好的RNA是进行基因克隆以及其功能分析的一个重要环节，也是进行分子生物学研究首先要解决的问题。目前，虽已建立了多种从各种动、植物组织中提取高质量总RNA的方法[1～3]，以食用菌为材料提取总RNA的方法亦有报道[4～9]，但关于冬虫夏草总RNA的提取方法却未见报道。基于此，作者以冬虫夏草子实体为材料，用4种方法对其总RNA进行提取，以便从中找出一种较适合冬虫夏草子实体总RNA提取的方法，为其分子生物学及基因工程育种研究的开展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜冬虫夏草子实体由延安大学生命科学学院食用菌实验室提供。

1.2 试验方法

①RNA的提取称取一定量的新鲜冬虫夏草子实体，分别采用SDS抽提法、TRIzol法、CTAB-Li-Cl法与DEPC水法进行总RNA的抽提。

②RNA质量的检验 a.RNA的纯度检验。RNA的纯度检验用核酸蛋白检测仪进行检测[10]。

b.RNA的完整性。根据所测的浓度，取相同含量的RNA在稳压7.5 V/cm下进行变性琼脂糖凝胶电泳，EB染色5～10 min，在凝胶成像系统中成像观察。

2 结果与分析

2.1 总RNA样品的纯度分析

将所提取的总RNA经紫外检测其230 nm、260 nm、280 nm处的 OD值并计算 OD260/OD230与OD260/OD280。从表1中可以看出，4种方法提取的总RNA 的 OD260/OD280值均在 1.900～2.303，OD260/OD230的值均在1.845～1.965，表明4种方法提取的总RNA纯度均较高，能有效地去除多糖等杂质，但仍有蛋白及盐分的残留，同时，可能有部分RNA发生降解导致OD260/OD280的值偏离2.0，这也与电泳结果（图1）相吻合。从整体数据分析可得出，DEPC水法和SDS法提取的冬虫夏草子实体总RNA纯度高于CTAB-LiCl法和TRIzol法提取的。

2.2 RNA的完整性分析

表1 4种方法抽提的总RNA纯度及产量的比较

4种方法提取的总RNA经变性琼脂糖凝胶电泳（图1）均出现整齐、较清楚的28S与18S条带。其中DEPC水法提取的总RNA电泳结果显示，28S、18S 与5S带型整齐，无拖尾，且28S带的亮度约为18S带的2倍，5S带很弱，点样孔中及其附近也未发现有DNA的污染，可以看出DEPC水法提取得到的总RNA纯度高、降解少、完整性好、得率高；SDS法提取的总RNA电泳结果出现了28S、18S两条完整性好且清晰的条带，但亮度较DEPC水法的暗，表明SDS法提取的 RNA量较DEPC水法低；TRIzol法、CTAB-LiCl法提取得到的总RNA电泳结果显示28S、18S两条条带较为模糊，表明RNA有不同程度地降解。4种方法的5S带很弱或没有则表明所使用的样品比较新鲜，而且裂解液比例适当，成分也很适合该样品的提取。

图1 4种方法抽提的总RNA电泳

3 小结与讨论

①本试验所采用的4种方法均需研磨、抽提、沉淀、洗涤4个步骤。4种方法除研磨和洗涤2个步骤完全相同外，其在抽提过程所用试剂、抽提次数及沉淀过程中所用试剂和沉淀次数均有所不同，所耗费时间也不同，见表2。结合紫外及电泳检测结果可得出，4种提取方法中DEPC水法提取的总RNA质量最好，SDS抽提法次之，CTAB-LiCl法和TRIzol法效果最差。DEPC水法所用的全部试剂均为常规试剂，这使得试验成本大大降低，而且整个提取过程操作非常简单、易行，耗时较短，不需要特别的仪器设备，所得RNA完整且纯度较高，可满足分子水平试验的要求，是一种较简单、高效、经济的适合食用菌总RNA提取的好方法。

②与动、植物组织相比，冬虫夏草的组成成分和结构与其有一定的差异，尤其是其高含量的多糖以及糖蛋白会形成难溶的胶状物等，严重影响RNA的提取效率和纯度，进一步影响到后续试验操作。本试验针对冬虫夏草子实体富含多糖的特点，在4种提取方法上，进行了简单的优化，即在抽提的过程中加入1/3体积的5 mol/L（pH=4.8）醋酸钾溶液以沉淀多糖，结果表明醋酸钾能够较好地除去多糖的污染。