犬γ干扰素多克隆抗体的制备及生物活性检测

李一经，吴 昱，唐丽杰，葛俊伟，乔薪瑗，崔 文，姜艳平

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030）

IFN-γ为II型干扰素或免疫干扰素，主要由活化T淋巴细胞和NK细胞产生，是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能的分泌性蛋白，相对于IFN-α和IFN-β，IFN-γ相关研究较少。Hiummler等率先开始犬IFN-α基因的研究[1]，随后Devos等克隆了犬IFN-γ基因[2]，夏春、汪明等也克隆过德国牧羊犬和拉布拉多犬IFN-α基因序列[3]。2002年杨琪等克隆了犬IFN-γ cDNA并在鼠骨髓瘤细胞(SP20)中进行了表达[4]。IFN-γ具有抑制病毒复制、抑制细胞分裂以及免疫调节作用[5]。主要表现在：①促进MHCI类及II类抗原的加工提呈，提升CD4+T细胞的肽特异性活性[6-7]。②介导T细胞对巨噬细胞的激活，增强巨噬细胞杀伤微生物的能力。③活化NK细胞，提高NK细胞的杀伤活性，同时活化的NK细胞也能分泌IFN-γ。④促进NO的合成，是IFN-γ杀伤胞内病原体、抗肿瘤以及抑制病毒复制的分子机制之一[8]。

本研究构建了含有CaIFN-γ基因原核表达载体，并实现高效表达；进一步对复性后的包涵体进行干扰素抗病毒活性检测；并将切胶纯化后的包涵体免疫家兔，制备兔抗犬IFN-γ的多克隆抗血清，为开发新型基因工程苗、新型免疫佐剂及免疫治疗剂奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌DH5α,E.coliRosetta，MDCK细胞，原核表达载体pET30a由东北农业大学预防兽医学微生物教研室保存，重组pJLA605-CaIFN-γ质粒由东北农业大学预防兽医学微生物教研室构建并经序列鉴定；水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）为哈尔滨兽医研究所惠赠；IPTG（购自TaKaRa公司）；弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（购自Sigma公司）；限制性内切酶SalI、EcoR I及DNA Marker、T4DNA ligase、Taq酶（购自宝生物工程（大连）有限责任公司）；小量质粒DNA提取试剂盒与小量胶回收试剂盒均购自中科瑞泰生物有限公司；MTT购自Fluka公司，其他试剂均为国产分析纯。实验动物为2月龄家兔（购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心）。

1.2 方法

1.2.1 引物设计合成

根据2005年张海峰[9]发表的CaIFN-γ基因序列设计引物用于重组载体的构建。P1:5'AGATCTTTCTTTAAAGAAATTG 3'，P2:5'GTCGA CTCACTATTTACTTGCTCTA 3'。

1.2.2 CaIFN-γ原核表达载体的构建及工程菌的诱导表达

pJLA605-CaIFNγ质粒和pET30a载体经EcoR I、SalI双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳得到的酶切产物在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，转化到DH5a感受态中，挑菌落过夜培养后提取质粒,双酶切与PCR鉴定[10]。阳性重组质粒命名为pET30a-caIFNγ。将阳性质粒热转到E.coliRosetta感受态中，挑阳性克隆菌于含卡那霉素（30 μg·mL-1）的LB培养液，37℃过夜振荡培养后，将菌液按1:50接种于含有卡那霉素的 100 mL锥形瓶中，37℃培养至OD600约为0.4，加入IPTG至终浓度为2 mmol·L-1，继续诱导培养并每小时取样。

1.2.3 表达产物的SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定

将IPTG诱导前和诱导后每小时的1 mL菌液12 000 r·min-1离心1 min，弃上清，加入50 μL PBS和等量2 x SDS（含DTT），煮沸10 min，取10 μL经15%SDS-PAGE分析。将表达量最大的诱导菌液的上清和沉淀分别处理，确定蛋白表达形式。用半干转印仪经50 mA、40 min转印到硝酸纤维素（NC）膜上，再将NC膜在PBS配制的5%脱脂乳中封闭2 h，以1:1 000稀释的his单抗室温作用2 h，DAB显色。

1.2.4 目的蛋白的复性

诱导的菌液，通过尿素梯度法进行包涵体粗提，采用切胶纯化反复冻融的方法得到包涵体[11]，分5次加入到pH为8.0，0.5 mmol·L-1精氨酸复性液中，使蛋白终浓度为0.15 mg·mL-1，4℃作用24 h，然后将复性液放入透析袋中，浸入pH 7.2，0.15 mmol·L-1PBS中充分透析，用PEG6000浓缩至1/10体积，然后以0.22 μm的滤膜进行过滤除菌，用于细胞检测蛋白的生物活性[12]。

1.2.5 抗病毒活性检测

在96孔板上长满单层的MDCK细胞中，加入以培养基进行2倍倍比稀释的重组干扰素复性蛋白作用24 h（蛋白初始浓度为1.5 mg·mL-1，每个梯度做4个平行孔，共8个梯度），弃液，加入100 TCID50的VSV作用24～30 h，同时做细胞和病毒对照组，当细胞病毒组80%～90%病变时，进行结晶紫染色。通过细胞病变抑制法对重组干扰素抗病毒活性进行分析[12]。

1.2.6 多克隆抗血清的制备

取切胶纯化浓度为2 mg·mL-1的重组蛋白1 mL加入1 mL弗氏完全佐剂，充分乳化后，颈部背部皮下多点注射2月龄家兔。首免后14和28 d分别用纯化蛋白1 mL加入弗氏不完全佐剂，进行加强免疫，于末次免疫后10 d，采血并分离血清。用间接ELISA方法测定抗体水平[13]。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的鉴定

重组质粒pET30a-caIFNγ经EcoR I、SalI单、双酶切和PCR鉴定。0.8%琼脂糖凝胶电泳显示，双酶切和PCR检测的插入片段长约440 bp，与预期结果相符。表明成功将编码CaIFN-γ成熟蛋白的基因正确插入到原核表达载体的目的位点（见图1）。

图1 重组质粒pET30a-caIFNγ的酶切和PCR鉴定Fig.1 Enzyme digestion and PCR identification of recombinant plasmid of pET30a-caIFNγ

2.2 融合蛋白的表达、鉴定

15%SDS-PAGE分析表明,与诱导前比较，每小时诱导样品均有一条明显的蛋白带，该蛋白的相对分子质量约为23 ku，并且在诱导后5 h重组蛋白表达量达到最大，重组蛋白约占菌体总蛋白含量的63%。见图2。

将第5 h诱导的菌体沉淀进行超声处理，分别进行上清和沉淀的SDS-PAGE分析表明，蛋白主要以包涵体的形式存在，见图3。Western Blot检测可见重组蛋白与抗His标签的单抗发生特异性反应，结果表明重组的犬γ干扰素蛋白在大肠杆菌中获得了表达。见图4。

图2 重组菌pET30a-CaIFN-γ/Rosetta不同时间的蛋白表达Fig.2 Expression of recombinant strains pET30a-CaIFN-γ/Rosetta in different Time

图3 重组蛋白CaIFN-γ的表达形式分析Fig.3 Expression of the inclusion body of recombinant protein CaIFN-γ

图4 重组蛋白CaIFN-γ的Western-blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombinant protein CaIFN-γ

2.3 重组蛋白CaIFN-γ的纯化与复性

结果见图5。

由图5可知，经尿素梯度法粗提的包涵体，进行切胶反复冻融之后浓缩平衡得到纯度较高的目的蛋白。复性后，在约23 ku处有条清晰的重组CaIFN-γ目的蛋白带。

图5 重组CaIFN-γ蛋白的切胶纯化和复性后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein CaIFN-γ by gel isolation and renaturation

2.4 重组CaIFN-γ蛋白复性后活性检测

2倍倍比稀释的重组CaIFN-γ蛋白作用于MDCK细胞，在2-4稀释度（蛋白终浓度为0.09 mg·mL-1）于24 h之内对接种VSV病毒的MDCK细胞有完全保护作用，见图6。超过24 h后有不同程度的细胞病变产生。通过细胞病变抑制法结果显示犬γ干扰素的抗病毒比活性为5.71×105U·mg-1。

图6 重组CaIFN-γ对100TCID50VSV增殖24 h后的抑制作用Fig.6 Inhibition effect for the recombinant CaIFN-γ on replication of VSV after 24 h

2.5 多抗血清效价间接ELISA结果

以纯化后浓度为1.25 μg·mL-1的重组蛋白包被ELISA反应板，每孔100 μL，于4℃包被过夜，用1×PBS稀释的5%脱脂乳于室温封闭2 h，将待检血清以2倍倍比稀释后加入反应板室温作用2 h，对照采用未免疫健康兔血清并倍比稀释，二抗1:5 000室温作用2 h，计算结果。最后测定血清效价为1:12 800。

图7 血清抗体效价测定结果Fig.7 Titrations of the antiserum prepared from immunized rabbit by ELISA coated with recombinant protein CaIFN-γ

3 讨论与结论

干扰素因干扰病毒复制而得名，大量研究表明，干扰素除抗病毒外，还具有重要的免疫调节作用[14]。干扰素的抗病毒作用是间接地通过自分泌或旁分泌途径，与细胞膜上的相应受体结合后，活化多条细胞信号传导通路上的蛋白分子来调节细胞的生长、分化，产生抗病毒效应及免疫反应等效应[15]。

本试验用前期获得的犬γ干扰素基因与pET30a原核表达载体成功构建重组质粒，经鉴定正确后，热转于大肠杆菌表达菌Rosetta中进行高效表达。通过对SDS-PAGE的分析表明，诱导5 h后，蛋白表达量达到峰值，同时上清和菌体的分别处理进一步确定蛋白以包涵体表达为主，这与大肠杆菌的结构及强启动子表达系统有关。一定程度上，利于蛋白的纯化，防止被蛋白酶降解。

虽然大肠杆菌表达的γIFN没有糖基化修饰，但研究表明仍具有生物活性[16]。各种动物IFNγ的氨基酸同源性不同，但其基本的空间结构类似。IFN的生物学效应具有高度的种属特异性，即人IFN对动物没有生物学活性，反之亦然[17]。本试验中，将复性后的蛋白进行生物活性检测发现，2-4倍稀释的蛋白在24 h内对细胞有较好的保护作用，但随着时间变化，病毒的繁殖，24 h后会有不同程度的病变。而2-1，2-2，2-3稀释度蛋白有一定的毒性作用，未接种病毒时，对细胞已经造成损伤，这可能与加入目的蛋白浓度过高，大肠杆菌内毒素以及细胞营养成分不充分有关。而2-5，2-6，2-7，2-8会有不同程度的细胞病变，这可能跟目的蛋白稀释后浓度过低，抗病毒作用减弱有关。

与昂贵而繁琐的镍柱纯化相比，本试验采用反复冻融切胶纯化法纯化蛋白，此方法适用于包涵体形式的高表达量蛋白纯化，操作方便，试验周期短，价格低廉，应用范围广。而且采用KCl染色，不影响蛋白抗原性及后续纯化。

本研究获得的具有体外抗病毒活性的重组γ干扰素蛋白和抗γ干扰素蛋白的多克隆抗体，为γ干扰素的深入研究和在生产应用奠定基础。

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