KDR等6个基因多态性与鸡生长和体组成性状的相关研究

吴宪文，金鹏程，王守志，张 慧，李 辉

（农业部鸡遗传育种重点实验室，东北农业大学动物科技学院，哈尔滨 150030）

试验前期通过鸡腹脂性状的全基因组关联分析（GWAS）鉴定出多个与鸡腹脂性状显著相关的多态性位点，其中6个位点分别为rs14483313（命名来源于60 K SNP芯片，下同）位于Ⅲ型酪氨酸激酶受体（a type III receptor tyrosine kinase,KDR/FlkⅠ/VEGF-2）上；rs13548811位于鸡肿瘤候选抑癌基因3（Tumor suppressor candidate 3,TUSC3）上 ；GGaluGA262999位于磷酸核糖焦磷酸转氨酶（Phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase,PPAT）上；GGaluGA263078位于胞外复合体成分1（Exocyst complex component 1,EXOC1）上；GGaluGA176566位于v-myb鸟类成髓细胞血症病毒致癌基因同系物2（v-myb myeloblastosis viral oncogene homolog(avian)-like 2,MYBL2）上；rs14482748位于 KIAA 1211上；这些位点的多态性与肉鸡高、低腹脂双向选择品系第11世代的腹脂重和腹脂率显著相关。

本研究对6个多态位点在高、低脂肉鸡双向选择品系第14世代群体和AA随机群体中进行SNPs检测和关联分析，旨在研究这6个基因的多态位点与鸡生长和体组成性状的相关性，从而为后续开展相关基因的功能研究和寻找可用于肉鸡育种的分子标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 鸡群和性状的测定

以东北农业大学动物科技学院选育的高、低脂肉鸡双向选择品系第14世代群体（NEAUHLFG14）612个体（高脂系320个体，低脂系292个体）和AA肉鸡商业随机群体386个体为试验材料。试验鸡群按常规方法进行饲养管理，7周龄时翅静脉采血，EDTA-Na2抗凝，酚∶氯仿抽提DNA之后，TE溶解，-20℃保存。测定1、3、5、7周龄体重（Body weight,BW）、屠体重（Carcass weight,CW）、腹脂重（Abdominal fat weight,AFW）、腹脂率（Abdominal fat percent,AFP）（腹脂重/体重）、肝脏重（Liver weight,LW）、心脏重（Heart weight,HW）、脾脏重（Spleen weight，SpW）、睾丸重（Testicle weight,TeW）、极低密度脂蛋白浓度（Very low density lipoproteins,VLDL）。

1.2 引物设计

结果见图1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

根据本实验室鸡腹脂性状的全基因组关联分析提供的多态性位点数据和鸡基因组测序结果（www.genome.ucsc.edu），使用Primer 5.0软件设计6对引物用于多态性检测，引物由北京英骏生物公司合成，如表1所示。

1.3 基因分型

根据六个多态位点，采用PCR-RFLP方法对高、低脂肉鸡双向选择品系第14世代群体和AA肉鸡商业随机群体个体进行基因型分析。PCR反应体系（25 μL）：50 ng·μg-1基因组DNA 1 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 2 μL、10 μmol·L-1上下游引物各0.5 μL、5 U·μL-1TaqDNA聚合酶0.25 μL、去离子水18.25 μL。PCR 反应条件：预变性条件均为94℃，5 min；变性条件均为94℃，30 s；延伸条件均为72℃，20 s；终极延伸条件均为72℃，5 min。退火条件、循环数及酶切条件如表2所示。内切酶由NEB公司提供，酶切反应体系（20 μL），按照使用说明进行配置。

表2 各位点PCR及酶切条件Table 2 Conditions of PCR，PCR-RFLP

1.4 统计分析

根据高、低肉鸡腹脂双向选择品系群体的特点，构建基因型效应统计模型①，根据AA肉鸡商业随机群体的特点，构建基因型效应统计模型②：

其中Y为性状观测值，μ为群体均值，G为基因型固定效应，L为品系固定效应，G*L为基因型和品系互作效应，F（L）为品系内的家系效应，D（F,L）为家系内与品系内母鸡的随机效应，S为性别固定效应，G*S为基因型和性别互作效应，F为家系的随机效应，D（F）为家系内母鸡的随机效应，BW7为7周龄体重做为屠体组成性状的校正因子，e为剩余值效应。

运用统计软件JMP4.0（SAS公司,2000）进行相关分析；采用SAS9.1.3软件对高、低肉鸡腹脂双向选择品系间基因型频率和等位基因频率差异进行χ2独立性检验。

2 结果与分析

2.1 PCR-RFLP检测

结果见图1。

图1 PCR-RFLP基因分型Fig.1 PCR-RFLP patterns

针对以上六个位点用相应的引物对高、低肉鸡腹脂双向选择第14世代群体和AA肉鸡商业随机群体基因组DNA进行PCR扩增，扩增片段与目的片段大小一致且特异性较好。采用RFLP的方法进行个体基因型分析。PCR产物经过酶切后均产生3种基因型，分型及命名见图1。图1中A-E分别对应为SNP1-6的基因分型图片。

2.2 群体遗传学分析

对六个突变位点在NEAUHLF第14世代中进行群体遗传学分析，检验结果表明基因型频率、等位基因频率分布在高、低腹脂双向选择品系间均存在极显著差异（P＜0.01）。SNP1和SNP3位点TT基因型和T等位基因在低脂系中的频率极显著高于在高脂系中的频率，CC基因型和C等位基因在高脂系中的频率极显著高于在低脂系中的频率。SNP2、SNP4和SNP5位点TT基因型和T等位基因在高脂系中的频率极显著高于在低脂系中的频率，CC基因型和C等位基因在低脂系中的频率极显著高于在高脂系中的频率。SNP6位点AA基因型和A等位基因在高脂系中的频率极显著高于在低脂系中的频率，GG基因型和G等位基因在低脂系中的频率极显著高于在高脂系中的频率，如表3所示。

表3 六个位点不同基因型、等位基因频率在高、低脂系两系间的分析Table 3 Comparisons of frequencies of genotype and allele in two lines of chicken divergently selected for abdominal fat content

2.3 6个位点多态性与鸡生长和体组成性状的相关分析

在高、低肉鸡腹脂双向选择品系第14世代群体和AA肉鸡商业随机群体中进行基因型与生长和体组成性状的相关分析，各位点对性状的影响（P值）见表4，基因型效应间的多重比较结果见表5。结果表明SNP1位点的多态性对NEAUHLFG14的AFW、AFP、CW和LW 有显著影响（P＜0.05），并且这四种性状的CC和CT基因型个体最小二乘均值（以下简称为均值）均显著高于TT基因型个体（P＜0.05）。

SNP2位点的多态性对NEAUHLFG14的BW7、HW和VLDL有显著影响（P＜0.05），BW7和VLDL的CC和TC基因型个体均值显著高于TT型个体（P＜0.05），HW的TT和TC型个体均值显著高于TT型个体（P＜0.05）；该位点的多态性对AA群体的SpW有显著影响（P＜0.05），且CC型个体均值显著高于TC和TT型个体（P＜0.05）。

表4 六个多态位点对高、低脂双向选择品系14世代和AA肉鸡商业随机群体生长和体组成性状的影响Table 4 Effects of six polymorphism on growth and body composition traits in NEAUHLFG14 and Arbor Acres（AA）commercial random population

表5 高、低脂双向选择品系第14世代中各位点基因型间多重比较Table 5 Multiple comparisons among least-squares means with different genotypes in NEAUHLFG14

SNP3位点的多态性对NEAUHLFG14的VLDL有显著影响（P＜0.05），且TT型个体均值显著高于TC和CC型个体（P＜0.05）；该位点的多态性对AA群体的LW有显著影响（P＜0.05），且TC型个体均值显著高于TT型个体（P＜0.05）。

SNP4位点多态性对NEAUHLFG14的BW7、CW、HW和VLDL有显著影响（P＜0.05），CC型个体的VLDL和HW显著高于TC和TT型个体（P＜0.05），CC和TC基因型个体的BW7显著高于TT型个体（P＜0.05），CC型个体的CW显著高于TT型个体（P＜0.05）；该位点的多态性对AA群体的BW7和SpW有显著影响（P＜0.05），且TT型个体的BW7显著高于TC和CC型个体（P＜0.05），CC型个体的SpW显著高于TT型个体（P＜0.05）。

SNP5位点多态性对NEAUHLFG14的SpW有显著影响（P＜0.05），且CC型个体均值显著高于TC和TT型个体（P＜0.05）；该位点的多态性对AA群体的BW3有显著影响（P＜0.05），TT型个体均值显著高于CC型个体（P＜0.05）。

SNP6位点多态性对NEAUHLFG14的VLDL有显著影响（P＜0.05），且GG型个体均值显著高于AA和AG型个体（P＜0.05）；该位点的多态性对AA群体的BW1和LW有显著影响（P＜0.05），且AA个体BW1显著高于AG和GG型个体（P＜0.05），AA和AG型个体的LW显著高于GG型个体（P＜0.05）。

3 讨论与结论

rs14483313突变位于KDR基因上，KDR基因也叫做FlkⅠ、VEGF-2，血管内皮生长因子2（Vascular endothelial growth factor-2,VEGF-2）是血管内皮生长因子家族成员[1]，它与血管的生成及造血功能有关[2]。有研究表明血管生成与脂肪生成在时间和空间上有很大的联系。在时间上关于脂肪组织发育研究指出，胚胎期血管的生成早于脂肪的生成[3]。在空间上新的血管生成总是伴随着脂肪细胞的分化，在这个过程中VEGF是关键因子[4]。肥胖与骨骼肌毛细血管密度降低有关[5]，抑制血管生成可以减少脂肪聚集[6-9]。可以看出血管生成与脂肪生成之间存在密切关系。

本研究结果显示，rs14483313（SNP1）突变对AA肉鸡商业随机群体腹脂性状的影响未达到显著水平。但对高、低脂肉鸡双向选择品系第14世代AFW和AFP都有显著影响（P＜0.05），这与前期GWAS在高、低脂肉鸡双向选择品系第11世代所得结果一致。该位点在NEAUHLFG14的低脂系中所有个体均为TT基因型，推测T等位基因有可能经过前几个世代的选择已固定。从基因型效应来看，TT基因型个体AFW、AFP显著低于CC型个体（P＜0.01），所以，T等位基因是降低鸡腹脂沉积的等位基因，在育种中可以尝试选择TT基因型个体培育低脂肉鸡品系。

研究发现，rs13548811（SNP2）突变对高、低脂肉鸡双向选择品系第14世代群体后期体重性状有影响，从3～7周龄逐渐增大，到3、5周龄时已接近显著（P值分别为0.0736，0.0637，表4中未给出），7周龄时达到显著水平（P＜0.05）。CC型个体的7周龄体重显著高于TT型个体（P＜0.05），CC基因型和C等位基因在低脂系中的频率显著高于在高脂系中的频率，以此推断CC基因型为高、低脂系中体重性状的有利基因型，可以尝试在育种中通过选择此基因型个体提高鸡的体重性状。

GGaluGA263078（SNP4）突变对鸡7周龄体重有显著影响，尤其在NEAUHLFG14和AA群体遗传背景不同的群体中该位点对BW7的影响一致（P＜0.05），因此推测该位点很可能是影响鸡体重性状的致因突变位点，或与致因突变位点紧密连锁。

本文所研究的6个突变位点在高、低脂肉鸡双向选择品系第11世代中都与腹脂性状显著相关，但在NEAUHLFG14和AA群体中却无一致结果。群体的遗传背景不同是造成群体间相关分析不一致的重要原因之一。高、低脂双向选择品系是一个对腹脂性状经过多世代选择的群体，随着从第11世代到第14世代的选择，该群体基因组位点间连锁不平衡程度发生了变化；与高、低脂双向选择品系群体相比，AA随机群体未经过特定性状选择群体，其遗传背景（基因的等位基因频率、基因位点连锁不平衡程度等）不同的。这时突变位点与影响鸡腹脂性状的致因突变紧密连锁。

在这6个突变位点中有4个（SNP2、SNP3、SNP4和SNP6）都与NEAUHLFG14的VLDL浓度显著相关（P＜0.05）。有研究表明，VLDL浓度是间接度量鸡体肥度的最好指标，血浆VLDL浓度与腹脂重和腹脂率呈显著的正表型相关，相关系数为0.4168和0.3576[10]，对血浆VLDL浓度的低向选择会使腹脂沉积减少[11]。结果表明，这些基因可能对鸡的腹部脂肪组织生长和发育发挥重要作用。

综上所述，这六个基因可能是影响鸡腹脂性状的重要基因，但本研究中的多态位点是否为功能性位点需进一步验证。

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