基于SSR分子标记的栽培种茄子遗传多样性分析

孙源文陈钰辉刘富中张映连勇

（农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

茄子（Solanum melongenaL.）在世界各地广泛栽培，我国是世界第一茄子生产大国（FAO，2009）。我国作为茄子的栽培驯化起源地之一（Daunay et al.，2001），茄子品种类型繁多，种质资源十分丰富。茄子不同品种资源在开展度、株高、花冠色泽、果皮颜色、果形、单果质量等农艺性状方面存在差异，而且不同性状在不同材料之间表现出不同程度的多样性（詹园凤 等，2007；赵德新 等，2009；文林宏 等，2010；梁任繁 等，2011）。

关于茄子种质资源遗传多态性已有应用AFLP（廖毅 等，2009）、RAPD（冉进 等，2007；王秋锦 等，2007；陈杰 等，2008）、SRAP（房超 等，2011；李怀志 等，2011）及ISSR（毛伟海 等，2006）等分子标记技术分析的相关报道，基本认为茄子的遗传基础相对较狭窄。然而，由于各自的取材、标记技术及分析方法不同，对资源材料的分类及其与地理来源的相关性存在很大的争议。

SSR（simple sequence repeat）是建立在PCR 技术上的一种广泛应用的分子标记，具有含量丰富、多态性高、共显性等优点。因其DNA样本用量少、技术操作简便、重复性和稳定性好，在番茄（宋建 等，2006）、辣椒（罗玉娣 等，2006）、玉米（肖木辑 等，2006；母贵琴 等，2011）、黄瓜（穆生奇，2008）、马铃薯（段艳凤 等，2009）、甘薯（赵冬兰 等，2011）、水稻（杨文毅 等，2011）等作物遗传多态性分析及遗传连锁图谱构建等方面的研究中广泛应用。本试验利用SSR分子标记对34份商品果实性状差异明显、具有代表性和地理来源不同的栽培种茄子高代自交系进行遗传多样性分析，希望为茄子分子标记辅助育种提供进一步的理论依据和实践参考。

表1 34份供试茄子材料农艺性状和来源

1 材料与方法

1.1 材料

试验以34份经多年自交选育的农艺性状遗传稳定、地理来源不同的栽培种茄子高代自交系为供试材料（表1）。

茄子SSR引物序列参照Nunome等（2009）的引物，选取基本覆盖茄子12条染色体的105对引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 果实性状调查 34份供试材料于 2010年春季统一种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所廊坊试验基地温室，每个材料种植 2行，每行6株，田间管理按常规方法统一进行。按照《茄子种质资源描述规范和数据标准》（李锡香，2006）的记载标准，对供试材料果实性状（果形、果皮色、果萼色）进行调查。

1.2.2 DNA提取 苗期取新鲜叶片5～10 g，利用改良CTAB法提取DNA。1.5 mL离心管中加入一片新叶（约0.2 g）液氮速冻研磨至细粉末，加700 μL CTAB在65 ℃水浴1 h；加入700 μL氯仿/异戊醇（24V∶1V）摇晃均匀，4 ℃ 12000 r·min-1离心10 min；吸上清液500～600 μL，加入800 μL预冷的无水乙醇轻轻颠倒混匀，4 ℃静置抱团；倒去乙醇，加入800 μL 75%乙醇清洗两遍；50 ℃烘箱干燥1 h，加入100 μL双蒸水缓冲液，充分溶解DNA沉淀后加入 2 μL RNaseA（10 mg·mL-1），37 ℃温浴 10 min，-20 ℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增及标记检测 总反应体系10 μL：模板DNA 100 ng（1μL），引物共0.6 μL，Green Master Mix 5 μL，ddH2O 3.4 μL。

扩增条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

扩增产物采用JY-JX5双垂直电泳槽（186 cm×95 cm），在非变性聚丙烯酰胺凝胶（20%）和0.5×TBE缓冲溶液条件下电泳分离。AgNO3染色、观察、拍照，统计条带。

1.3 数据统计分析

1.3.1 果实性状聚类分析 果实表型性状数据标准化处理：果皮色中紫红记为0，黑紫记为1；果形中圆形（包括圆球形、高圆形、扁圆形）记为0，筒形（包括长筒形、短筒形）记为1；果萼色中绿色记为0，紫色记为1；产地来源国外记为0，国内记为1。

统计数据按 UPGMA（unweight pair group method using arithmetic averages）方法，采用NTSYS-pc version2.10e软件进行聚类分析。

1.3.2 SSR标记聚类分析 SSR扩增产物以0、1、9统计建立数据库：在相同迁移率位置上，有带记为1，无带记为0，缺失记为9，根据不同分析软件的格式要求做相应的转换（肖木辑 等，2006）。

按UPGMA方法，采用NTSYS-pc version2.10e软件进行聚类，获得树状图；群体内某一位点的等位变异数和有效等位基因数、Shannon’s信息指数统计等用Popgene软件进行分析计算（任小平 等，2010）；每个SSR位点的多态性信息量（Polymorphism information content，PIC）按公式PIC=1-∑fi2计算，其中fi为i位点的基因频率（赵永锋 等，2011）。

2 结果与分析

2.1 SSR标记检测结果

本试验利用已公布的105对茄子SSR引物，对34份茄子供试材料基因组DNA进行PCR扩增反应和凝胶电泳检测，其中79对SSR引物在34份材料中共扩增出307个序列片段，谱带在100～800 bp之间（图1）。79对SSR引物中最少的可扩增出1条谱带，最多的可扩增出12条谱带，平均每对引物扩增出4.55条谱带，也说明这79对SSR引物能够用于本试验茄子材料的遗传多样性分析。

图1 引物SSR022扩增结果

2.2 多态性信息分析

通过Popgene软件对筛选出的79对SSR引物所建数据库进行分析，结果显示其中47对具有效多态性信息含量，共有148个多态性位点，位点多态性达到80.87%，有效等位变异所占比重为77.13%。这47对引物共含有214个等位基因（表2），等位基因的平均值约为4.55个，变幅2～12个。其中含有等位基因数最多是SSR003，共有12个等位基因，其次是SSR022和SSR001，为10个，SSR015为9个，SSR014和SSR139为8个；但有效等位基因（Ne）的平均值约为3.50个，变幅为1.0261～11.0295，其中SSR003、SSR022、SSR139含有的有效等位基因最多；每个标记的多态性信息含量（PIC）的平均值为 0.582800，变幅为 0.025436～0.909334，最高为SSR003，其次为SSR022、SSR139、SSR014；标记的基因型多样性指数（H）平均值为0.9898，变幅为0.0310～2.2034，SSR003和SSR022最高；Shannon’s信息指数（I）的平均值为1.2795，变幅为0.0810～3.1563。

标记的多态性信息含量（PIC）值基本与等位基因变异数目相对应，即等位基因变异较多的SSR引物一般都具有较高的多态性信息含量（PIC）值；本试验中 PIC＞0.5的引物有32对，0.25＜PIC＜0.5的引物有9对；PIC＜0.25的引物有6对。由以上数据分析可知，本试验聚类分析中遗传多态性较高的引物仅占全部的约30%，合适引物较少，多态性位点不足，可能无法将材料完全区分，也说明供试材料遗传多态性不高，遗传背景较狭窄。

2.3 聚类分析

2.3.1 基于果实表型性状的聚类分析 从果实表型性状聚类树状图（图2）可知，供试材料遗传相似系数在0.30～0.75之间，平均值为 0.52。在遗传相似系数 0.30处材料可分为两个大类群，即Ⅰ圆茄包括20份材料，Ⅱ长茄包括 14份材料，符合率达到100%；在遗传相似系数0.375处，圆茄类群分为a，b两个组群，a为果皮黑紫色组群，b为果皮紫红色组群；长茄类群分为 c，d两个组群，c是果皮黑紫色组群，d是果皮紫红色组群。每个组群在遗传相似系数0.508处都可划分为2个小群，圆果形、果皮黑紫色、萼片紫色的国内材料主要集中在a-1群中，长茄则分布在 c-1、c-2和 d-2群中。树状图表明根据果实表型性状能将供试材料进行粗略分类。

2.3.2 基于SSR标记的聚类分析 依据79对SSR引物的条带信息建立数据库，由 NTSYS-pc version2.10e软件进行聚类，获得树状图。由聚类树状图（图3）可以看出，供试材料遗传相似系数在0.63～0.93之间，供试材料之间的遗传差异不大，遗传基础相对狭窄。在遗传相似系数为0.63时，34份茄子材料可以分为两大类群。第I类群包括15份材?料，果实形状为圆形、果皮黑紫色、萼片紫色，来源于河北、天津、山西及河南；第Ⅱ类群包含19份材料，果实形状多为筒形。第Ⅱ类群材料在遗传相似系数0.75处可以分为Ⅱ-1和Ⅱ-2两个小组，Ⅱ-1小组包括6份供试材料，遗传相似系数变幅为0.75～0.85，果实形状为高圆或筒形，果皮紫红色，萼片多数为紫色，主要是来自国内的材料；Ⅱ-2小组包括 13份材料，遗传相似系数变幅为 0.79～0.93，果实形状从高圆到长筒均有，果皮黑紫色，萼片紫或绿色，全部来源于国外。基于SSR标记的聚类分析结果显示，利用SSR标记能将供试材料进行详细分类，材料主要依果形归类，与地理来源有一定的相关。

表2 34份茄子材料的SSR标记的等位基因数、有效等位基因和遗传多样性指数

图2 34份茄子材料基于果实表型性状聚类分析图

图3 34份茄子材料基于SSR分子标记聚类分析图

3 结论与讨论

本试验通过对105个SSR标记进行筛选，得到79个多态性标记，但只有47个标记在供试材料中具有多态性信息含量，且利用此47个标记构建的树状图与79个标记构建的树状图基本相同，逐渐增多标记，树状图基本不再发生变化，此结果说明，丰富有效的SSR标记是将试验材料区分开的基础，构建茄子遗传图谱，对特定性状进行定位，有助于区分不同茄子品种。

供试材料遗传相似系数在0.63～0.93之间，平均值0.78，说明多数材料间具有一定的遗传差异，但总体供试材料遗传基础相对比较狭窄，这与毛伟海等（2006）、冉进等（2007）用其他标记分析茄子材料遗传多样性结果相似。进一步说明育种中常用的茄子高代自交系的遗传相似性很高，遗传基础非常狭窄，也说明茄子品种选育的亲本材料非常有限。因此，在茄子育种中广泛收集和创造新的种质资源，积极引进国外优异种质资源，挖掘优良基因，扩大我国茄子育种的种质资源基因库，对提高我国茄子育种有重要意义。

基于分子标记或农艺性状聚类分析栽培种茄子分类的有许多报道，本试验中供试材料依据SSR标记和果实表型性状的聚类分析可将供试材料分为两大类，即圆茄和长茄，这与传统的Bailey（1929）和 Hara（1944）的茄子分类系统基本吻合。从二者树状图对比可知，基于 SSR标记的聚类分析较基于果实表型性状的聚类分析，划分得更详细，能更准确地反映种质的遗传基础。从本试验聚类结果看，基本可以按照果实农艺性状和来源大体进行归类，这可能与本试验供试材料的选择有关，材料主要来自北方地区及国外引进栽培种的茄子高代材料，来源地较为集中且果实性状和颜色变异较少。少数高圆果形材料（5、6、9、19、20号）被归类到Ⅱ类群长茄大类群，原因可能是没有筛选到合适的引物，导致这几份材料无法分开。本试验部分供试材料为国外引种，但其与我国材料的遗传相似性较高，这可能与地区、国家之间的种质交流频繁导致品种间遗传相似性增高有关；其次可能是利用分子标记多态性数据进行遗传多样性分析，必须要有足够的多态性位点，且这些位点能够尽量均匀覆盖整个基因组，而针对本试验标记位点分析结果表明，其未能均匀覆盖整个基因组。因此进一步开发筛选多态性信息量较高的 SSR分子标记，构建茄子遗传连锁图谱，对分子标记技术在茄子育种中的应用更具实际意义。

本试验利用SSR标记从分子水平上分析了茄子高代材料的亲缘关系，可以根据本结果在保证达到育种目标的前提下，在育种时选用不同类群的自交系配制组合，避免育种过程中出现遗传背景狭窄、变异度降低等问题，进而可以减少亲本选择、选配的盲目性，大大提高育种效率。

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