辣椒素类物质生物合成途径及其相关基因研究进展

吴智明 程蛟文 唐 鑫 胡开林*

（1仲恺农业工程学院园艺园林学院，广东广州 510225；2华南农业大学园艺学院，广东广州510642）

辣椒（CapsicumannuumL.）通常具有特殊的辛辣味，这主要是由于其果实中含有特殊的以辣椒素（capsaicin）为主的辣椒素类物质（capsaicinoids）。辣椒素的含量是评估辣椒果实品质性状的重要指标之一，同时辣椒素在当今食品（Perkins et al.，2002）、医药（Liu & Nair，2010）、军事（Reilly et al.，2001）和农药（刘新和林永，2003）等领域的应用也非常广泛，因此对于辣椒素的研究一直是农业、工业和医疗领域的热点。

辣椒素类物质的生物合成与积累主要受遗传基因控制，但同时也受到发育与外界环境条件的影响，不同辣椒品种或同一辣椒品种不同的生长发育阶段在辣度上均表现出很大的差异（Kozukue et al.，2005；Mueller-Seitz et al.，2008；李光光 等，2010）。了解辣椒素类物质在辣椒果实中的生物合成途径及其主要基因的功能，以及基因的表达调控机制，有助于人工调控辣椒素类物质的生物合成，对辣椒优质新品种选育具有重要的实践意义。

1 辣椒素类物质的种类

辣椒素最早是由Thresh在1876年从辣椒果实中分离出来的。1919年，Nelson（1919）报道了辣椒素的结构，并命名为8-甲基-6-癸烯香草基胺，分子式为C18H27NO3，是一种含香草酰胺的生物碱。此后，又有一些辣椒素的同系物相继从辣椒果实中被发现，统称为辣椒素类物质。所有辣椒素类物质都是C9～C11支链脂肪酸和香草基胺合成的酰氨化合物，不同辣椒素类物质的主要差异在于脂肪侧链长度、是否存在双键、分支点和相对辣度。据报道，迄今为止己发现近20种辣椒素类物质（Mazourek et al.，2009），主要包括辣椒素、二氢辣椒素（dihydrocapsaicin）、降二氢辣椒素（nordihydrocapsaicin）、高二氢辣椒素（homodihydrocapsaicin）和高辣素（homocapsaicin）等，5种主要的辣椒素类物质及其相关特性见表1。后来，又在甜椒果实中发现两种无辣味的类辣椒素物质（capsaicinoid-like substance，CLS）：辣椒素酯（capsiate）和二氢辣椒素酯（dihydrocapsiate），辣椒素酯具有与辣椒素类物质相同的侧链脂肪酸，但芳香成分却被香荚兰醇（vanillyl alcohol）代替，有学者推测其可能是辣椒素类物质合成的前体物（Kobata et al.，1998）。

表1 辣椒素类物质包含的主要种类及其特性

2 辣椒素类物质的生物合成

前期对辣椒素类物质在辣椒植株中的合成部位存在一定的争议。20世纪 60年代，有学者认为种子是辣椒素类物质的合成部位，也有学者则认为子房隔膜上的有些腺体细胞可以分泌辣椒素。1979年，Iwai等（1979）采用同位素示踪技术，研究认为辣椒素类物质在辣椒果实的胎座中积累。进一步研究结果表明，辣椒素主要在果实胎座表皮细胞的液泡中形成和积累，再通过子房膜（壁）运输到果肉表皮细胞的液泡中积累起来。辣椒素在果实不同部位的含量不同，胎座中的辣椒素含量最高，果肉次之，种子最低（Estrada et al.，2002），而果皮中的辣椒素以果实中段最多，近萼片端次之，近尖端最少（邹学校，2002）。对于辣椒素在辣椒果实中的合成时期，目前普遍认为，绝大多数的辣椒品种中辣椒素类物质的生物合成发生在开花后约20 d（Iwai et al.，1979）。

辣椒素类物质的生物合成途径相当复杂，这也导致了辣椒素类物质的多样性。关于辣椒素类物质的生物合成途径的研究始于20世纪60年代末。研究者通过同位素示踪技术研究辣椒素类物质合成的前体，发现部分香草基胺的合成前体是苯丙氨酸，而支链脂肪酸源于缬氨酸（Bennett ＆ Kirby，1968；Leete ＆ Louden，1968）。由此推测辣椒素类物质生物合成途径包含两条途径：以苯丙氨酸为前体的苯丙烷途径和以缬氨酸或亮氨酸为前体的支链脂肪酸途径。最近，Mazourek等（2009）在前人的研究基础上全面、详细总结了辣椒素类物质的生物合成途径，并建立了辣椒素类物质生物合成模型（CapCyc Model）（图1）：辣椒素类物质生物合成起始于莽草酸途径（shikimate pathway），在质体中先形成分支酸（chorismate）（步骤①），然后合成苯丙氨酸（phenylalanine）（步骤②）；在内质网上，苯丙氨酸转变为羟基肉桂酰辅酶A（feruloyl-CoA）（步骤③），随后由羟基肉桂酰辅酶 A裂解酶催化合成香草基胺（vanillylamine）（步骤④）。丙酮酸酯是缬氨酸的合成前体（步骤⑤），随后缬氨酸被转运到线粒体中催化合成异丁酰基-CoA（isobutyryl-CoA）（步骤⑥）；合成的异丁酰基-CoA再转运到质体中，在脂肪酸合酶催化下合成8-甲基-6-壬烯酸（8-methyl-nonenoic acid）（步骤⑦）；8-甲基-6-壬烯酸从质体转运到细胞质过程中合成硫代酸酯-CoA（8-methylnonenoic-CoA）。最后，硫代酸酯-CoA和香草基胺在辣椒素合成酶（CS）催化下合成辣椒素（步骤⑧），然后转运出细胞。

图1 细胞中辣椒素类物质生物合成示意图及合成途径

3 辣味基因的标记与QTL定位

早期的遗传学研究认为，辣椒辣味的产生是由单一显性基因C（Pun1）控制的，在纯合隐性基因c（pun1）作用下表现为辣味缺失，并且该基因对所有其他的辣味相关基因具有上位作用（Greenleaf，1952）。Tanksley等（1988）最先找到了一个与C基因连锁的分子标记CD35，但遗传距离大于10 cM。Ben-Chaim等（2001）最先将C基因位点定位于辣椒的第2号染色体上。后来，Blum等（2002）以甜椒品种Maor（Capsicum annuum）与高辣辣椒BG2816（Capsicum frutescens）为亲本，构建了包含242个单株的F2群体，通过RFLP标记方法，遗传作图证实C基因位于第2号染色体上，并首次获得了与C基因紧密连锁的3个RFLP标记和1个离C基因位点仅0.4 cM的CAPS标记。随后，Blum等（2003）在前期构建的F2群体基础上，利用BSA法筛选到3个在不辣基因池与辣味基因池之间表现多态性的RAPD标记位点，通过成功转换成SCAR标记后，将其中的一个主效QTL位点cap定位于辣椒的第7号染色体上，实验证明该QTL位点可解释在不同生境条件下表型变异的34%～38%。Lee等（2005）在一年生辣椒（Capsicum annuum）中分离到一个与C基因共分离的辣椒素合成酶基因（Capsaicin Synthase，CS），序列分析表明甜椒的CS基因5’上游区域存在一段2529 bp碱基缺失。

Ben-Chaim等（2006）以微辣辣椒品种 NuMex RNaky（Capsicum annuum）与高辣品种BG2814-6（Capsicum frutescens）为亲本，构建了包含396个单株的F2群体及相应的F3群体，同时构建了包括 SSR、AFLP、RFLP共 728个标记的分子图谱，找到了 6个与辣椒素类物质含量相关的QTL位点，并分别定位于第 3、4和 7号染色体上。分析表明，辣椒素类物质含量表型变化主要贡献（24%～42%）来自于主效QTL位点cap7.1和定位于2号染色体无主效作用的标记（NP0326）间的二基因作用，而QTL位点cap7.2很可能是Blum等（2003）证实的对辣椒素类物质含量有显著影响的QTL位点cap。Stewart等（2007）在C. chinense辣椒中发现了一个Pun1基因的等位基因位点，并命名为pun12。序列分析发现pun12位点存在4个碱基缺失，导致编码的蛋白质发生移码突变，最终导致辣椒辣味的散失。王岩等（2007）通过同源克隆法，从不同基因型辣椒中克隆了C基因的全长，序列比对分析证实，甜椒C基因5’端约689 bp的碱基缺失可能是造成其辣味散失的原因。最近，Stellari等（2010）又在另一个辣椒种Capsicum frutescens中发现了新的等位基因位点pun13，实验证明pun13转录本的缺失与辣椒辣味的散失相关。Wyatt等（2012）在前人研究基础上发展了一套标记，用以区别不同辣椒种中Pun1、pun11、pun12和pun13基因型，这些标记的获得为辣椒种质资源的鉴定与辣椒育种提供了很好的参考。

4 辣椒素类物质生物合成过程中基因的克隆

辣椒素的合成与累积除受结构基因C影响外，还受到诸多调控基因的控制。为了通过基因工程方法调控辣椒素的含量，探讨辣椒素生物合成的分子机理，研究者长期以来对辣椒素生物合成途径中的相关基因进行了克隆，并研究了相关基因表达与辣味之间的关系。到目前为止，已克隆的与辣椒素类物质生物合成相关的酶类基因超过50种（表2）。

其中，Curry等（1999）最先从转录水平检测了不同基因型辣椒果实发育过程中辣椒素合成相关酶的表达，从辣椒（C. chinense）胎座cDNA文库中筛选获得了参与辣椒素合成的3个特异酶基因：苯丙氨酸裂解酶（Pal）、肉桂酸羧化酶（Ca4h）和咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（Comt），研究表明，在辣椒果实发育过程中，这些基因的转录水平与辣椒素合成量呈正相关。Kim等（2001）利用抑制差减杂交（SSH）技术获得了4个与辣椒素代谢有关的基因片段。序列比对分析发现，这些片段与氨基转移酶（pAMT）、3-氧酰基〔酰基载体蛋白〕还原酶（Kas）、乙酰基转移酶（AT）、脂肪酸乙醇氧化酶（FAO）序列有较高同源性，这些基因在辣椒果实胎盘中特异表达，表达水平与辣椒素积累具有相同的模式。Aluru等（2003）研究脂肪酸合成酶复合物组成因子与辣味关系，通过差显的方法克隆了Kas、酰基载体蛋白（Acl）和硫酯酶（Fat）基因，并分别将它们定位于第1、1和6连锁群，实验证明KAS蛋白的积累与辣椒辣味呈正相关。Stewart等（2005）在Kim等（2001）分离的一个 EST（SB2-66）基础上，通过RACE方法获得了Pun1基因全长，并将其命名为AT3。研究认为Pun1基因编码一个在辣椒素合成过程中非常重要的酶，它可能是一个乙酰基转移酶。研究发现，AT3活性和表达量与辣味积累呈正相关，免疫方法证实AT3特异性定位到辣椒果实胎座，说明AT3可能是辣椒素生物合成途径中的关键基因。同时他们提出早期在Capsicum annuum的驯化中，决定不辣的Pun1位点上的缺失可能在种间广泛存在。Lee等（2006）从表达差异蛋白角度入手，综合采用蛋白质组学方法，研究了辣味和无辣味辣椒果实胎座组织抽提物中蛋白质表达的差异，结果表明 22个蛋白点在辣味辣椒中强烈表达，在无辣味辣椒果实胎座中则没有相对应的蛋白点。del Rosario Abraham-Juarez等（2008）利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术研究了Comt、pAMT和Kas基因表达水平与辣椒素的积累量关系，其中任何一个基因的沉默都会导致辣椒素含量的急剧下降。Lang等（2009）研究发现甜椒 CH-19是由有辣味辣椒pAMT基因在1291 bp处插入了一个碱基T，产生新的终止密码子TGA突变得到的。最近，Mazourek等（2009）定位并克隆了几十种辣椒素类物质生物合成过程中相关的酶类基因，如表2所示。

5 展望

辣椒素作为辣椒重要品质性状和医药、工业的重要原料，对其生物合成路径以及相关基因的表达、辣椒素含量的分子标记研究等都取得了重要进展。但目前的研究还没有明确辣椒素类物质生物合成路径的调控机制，包括一些关键基因的定位、克隆和调控的分子机理，相关基因启动子的分离和调控作用。而且，到目前为止，还没有真正能够利用基因工程的方法获得转基因植株，能自由调控辣椒果实中辣椒素的合成。这些都应该成为下一步研究的重点。

表2 与辣椒素类物质生物合成途径相关的酶

另外，辣椒素类物质种类繁多，除了辣椒素外其他不同类型的辣椒素类物质的生物合成过程还不清楚，而且一些环境因子如光照、温度、水分、肥料等在辣椒素的生物合成与积累过程中起着非常重要的作用，这些环境因子是如何影响辣椒素在果实中的合成的分子机理还值得进一步深入研究。

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