丙二酸次氮酰胺对刀豆蛋白刺激的胶原性关节炎模型大鼠CD4+CD25+调节性T淋巴细胞体外分化的影响

王婷玉，李俊，金芝贵，吴飞华，王小华，周倩（.上海交通大学医学院附属第九人民医院药剂科，上海000；.安徽医科大学药学院，合肥 3003）

来氟米特是病情缓解药，能够延缓类风湿性关节炎（RA）的疾病进展，改善患者症状，提高其生活质量，被广泛用于RA的治疗[1]。来氟米特是一种前体药物，在体内代谢成活性代谢物丙二酸次氮酰胺（A771726），以抑制二氢还原酶阻碍其合成嘧啶，从而抑制RA中淋巴细胞的增殖[2]。CD4+CD25+调节性T淋巴细胞（CD4+CD25+Tregs）是近年发现的一类具有独特免疫功能的细胞群，其以“主动”方式维持自身稳定，在调控外周自身反应性T淋巴细胞中发挥重要作用。本文以刀豆蛋白（ConA）刺激的胶原性关节炎（CIA）模型大鼠脾淋巴细胞为靶细胞，研究A 771726对体外培养的脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs分化的影响，考察A771726能否通过直接上调CD4+CD25+Tregs从而抑制脾淋巴细胞增殖；再进一步研究A771726诱导CD4+CD25+Tregs分化的作用机制，包括CD4+CD25+Tregs特异性标志物Foxp3的表达以及免疫性细胞因子的分泌。以期深入了解来氟米特抑制淋巴细胞增殖，进而治疗RA的作用机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Eclipse TE300型倒置显微镜（日本Nikon公司）；Muliskan MK3酶标仪（上海雷勃分析仪器有限公司）；Bio-RAD Power Pac Basic电泳仪（美国BIO-RAD公司）；FACScan流式细胞仪（美国BD公司）；Applied Biosystems基因扩增仪9700系统（美国Applied Biosystems公司）；GSG2000核酸/蛋白凝胶图像分析管理系统（珠海黑马医学仪器有限公司）。

1.2 试药

A771726原料药（美国欣凯公司上海代表处，批号：080716，纯度：96%）；Ⅱ型胶原（CⅡ，美国Sigma公司，批号：C7806）；小鼠抗大鼠FITC-CD4抗体和小鼠抗大鼠PE-CD25抗体（美国Caltag公司，批号：MR5101、MR6104）；RNA抽提试剂（Trizol）（美国Invitrogen公司，批号：15596-026）；转化生长因子β（TGF-β）酶联免疫（ELISA）试剂盒（上海森雄科技实业有限公司，批号：20080524）；聚合酶链式扩增（PCR）引物（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。

1.3 动物

Wistar大鼠20只，♂，体重（110±20）g，购于安徽医科大学实验动物中心，合格证号：皖医实动准字第01号。

2 方法

2.1 建模

取大鼠20只，随机均分为正常对照组和CIA模型组。将CⅡ溶入0.1mol·L－1的乙酸中制备成浓度为2 g·L－1的溶液，置于4℃搅拌过夜，与等体积弗氏不完全佐剂（IFA）混合，充分乳化，取0.5m L乳化后乳剂分5～6点分别注射于模型组大鼠背部脊柱两侧和尾根部的皮内，1周后同法注射同等剂量乳剂作为继发注射。正常对照组大鼠同法注射等量生理盐水。

2.2 脾淋巴细胞增殖反应

造模后第35天，股动脉放血处死大鼠，无菌分离脾脏，制备脾淋巴细胞悬液（1×106个/m L）。于96孔培养板上，每孔加入100μL细胞悬液，分为正常组、模型组和A771726低、中、高剂量（0.1、1、10 μmol·L－1）[3]组，每组3个复孔，除正常组加入正常对照组大鼠脾淋巴细胞悬液外，其余各组加入CIA模型组大鼠脾淋巴细胞悬液。各孔均加入50μL ConA（终浓度为3 μg·m L－1）刺激和相应药物培养液，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养48 h，于终止培养前6 h，每孔加入5mg·m L－1的MTT 10 μL，继续孵育6 h。每孔加150μL二甲基亚砜（DMSO）充分溶解，于酶标仪上检测570 nm波长处的光密度（OD）值，OD值越大，细胞增殖水平越高。

2.3 CD4+CD25+Tregs的检测

为了缩短实验时间，提高各个组间的平行性，本实验用药组仅选用剂量最大、药效最强的组进行实验，即分组为正常组、模型组和A771726高剂量组。于24孔培养板上，按“2.2”项下加入相应细胞悬液500μL，后2组分别加入250μL含ConA（终浓度为3 μg·m L－1）或A771726（终浓度为10 μmol·L－1）的RPM I-1640培养液，培养48 h，1 500 r·m in－1离心5m in，吸弃上清，每个样品中加入5μL小鼠抗大鼠FITC-CD4抗体和2 μL小鼠抗大鼠PE-CD25抗体，4℃避光孵育30m in，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，上流式细胞仪检测，计算CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例。

2.4 Foxp3和TGF-βm RNA表达的检测

分组和给药同“2.2”项下操作，药物作用于脾淋巴细胞悬液48 h后，1 500 r·m in－1离心5m in，吸弃上清，每个样品中加入1m L Trizol提取总RNA，鸟类成髓细胞白血病病毒（AMV）逆转录酶逆转录得到 cDNA。Foxp3（320 bp）上游：5′-TAATATGCGGCCCCCTTTCACCTA-3′，下游：5′-GCCCCCGTCCATGTTTTCTTG-3′；TGF-β（407 bp）上游：5′-ATACAGGGCTTTCGCTTCAGTGCT-3′，下游：5′-CCCGGGTTGTGTTGGTTGTAGAG-3′；肌动蛋白（β-actin）（543 bp）上游：5′-GATATCGCTGCGCTCGTCGTC-3′，下游：5′-GTCCCGGCCAGCCAGGTCCAG-3′。PCR扩增35个循环，PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，检测OD值，以β-actin的OD值为对照，计算目的基因mRNA的表达。

2.5 TGF-β浓度的检测

分组和给药同“2.2”项下操作，药物作用于脾淋巴细胞悬液 48 h 后，2 000 r·m in－1离心 10min，收集上清。用 TGF-β ELISA试剂盒检测上清中TGF-β的浓度。

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 脾淋巴细胞增殖比较

与正常组比较，模型组大鼠脾淋巴细胞增殖水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，正常对照组，A771726低、中、高剂量组大鼠脾淋巴细胞增殖水平明显降低（P＜0.05或P＜0.01）。各组大鼠脾淋巴细胞增殖水平详见图1。

图1 各组脾淋巴细胞增殖情况（n＝3）与正常组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01Fig 1 Proliferation of sp lenic lym phocyte in each group（n＝3）vs.normalgroup：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.05，##P＜0.01

3.2 CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例

与正常组比较，模型组大鼠脾淋巴细胞CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，A771726组大鼠脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例明显升高（P＜0.05）。各组脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例比较见图2。

3.3 各组大鼠脾淋巴细胞中Foxp3mRNA表达情况

正常组、模型组和A771726低、中、高剂量组大鼠脾淋巴细胞中 Foxp3 mRNA 表达分别为：1.33±0.08、0.61±0.07、0.78±0.04、0.95±0.03、1.06±0.06。结果表明，与正常组比较，模型组Foxp3mRNA表达明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，A771726低、中、高剂量组Foxp3mRNA表达明显升高（P＜0.01）。各组脾淋巴细胞中Foxp3mRNA表达的电泳图详见图3。

图2 各组脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例比较（n＝5）与正常组比较：＊P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05Fig 2 Comparison of the proportion of CD4+CD25+Tregs in CD4+T in sp lenic lymphocyteof each grou（pn＝5）vs.normalgroup：＊P＜0.05；vs.modelgroup：#P＜0.05

图5 各组脾淋巴细胞中TGF-β浓度比较（n＝5）与正常组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01Fig 5 Comparison of the content of TGF-βin Con A-induced sp lenocytes from CIA rat（sn＝5）vs.normalgroup：＊P＜0.01；vs.modelgroup：#P＜0.01

图3 各组脾淋巴细胞中Foxp3m RNA表达Fig 3 The expression of Foxp3m RNA in sp lenic lym phocyte of each group

3.4 各组大鼠脾淋巴细胞中TGF-βm RNA表达情况

正常组、模型组和A771726低、中、高剂量组大鼠脾淋巴细胞中TGF-β mRNA表达分别为0.32±0.03、0.06±0.01、0.08±0.02、0.12±0.01、0.18±0.04。结果表明，与正常组比较，模型组TGF-βmRNA的表达明显降低（P＜0.01）。A771726低、中、高剂量组TGF-βmRNA的表达明显升高（P＜0.01）。各组脾淋巴细胞中Foxp3mRNA表达的电泳图详见图4。象，在体外培养体系中，研究了来氟米特活性代谢产物A771726对ConA活化的CIA模型大鼠脾淋巴细胞中CD4+CD25+Tregs的影响。结果表明，在ConA诱导的CIA大鼠脾淋巴细胞体系中，A771726能提高CD4+CD25+Tregs占CD4+T淋巴细胞的比例，说明A771726对CD4+CD25+Tregs的分化具有促进作用。Foxp3特异性地高表达于CD4+CD25+Tregs，直接参与CD4+CD25+Tregs的发育，在一定程度上可反映CD4+CD25+Tregs的水平和功能活性[6]。A771726能剂量依赖性增强ConA诱导的CIA模型大鼠脾淋巴细胞中Foxp3mRNA的表达，表明A771726激活了CD4+CD25+Tregs的抑制功能。TGF-β是一种炎性反应的负性调控因子，参与CD4+CD25+Tregs的发育和功能维持[7]。A771726能促进ConA刺激的CIA模型大鼠脾淋巴细胞TGF-β的分泌及TGF-βmRNA表达的增强。

综上所述，A771726可抑制CIA模型大鼠脾淋巴细胞增殖，诱导CD4+CD25+Tregs的分化，其机制可能与上调TGF-β的表达和促进其分泌有关。

图4 各组脾淋巴细胞中TGF-βmRNA表达Fig 4 The expression of TGF-βmRNA in sp lenic lym phocyteof each group

3.5 各组大鼠脾淋巴细胞中TGF-β浓度比较

与正常组比较，模型组大鼠脾淋巴细胞中TGF-β浓度明显降低（P＜0.01）；与模型组比较，A771726中、高剂量组大鼠脾淋巴细胞中TGF-β浓度明显升高（P＜0.01）。各组脾淋巴细胞中TGF-β浓度比较见图5。

4 讨论

CD4+CD25+Tregs是近年发现的一类免疫调节细胞，在诱导和维持自身免疫耐受和阻止自身免疫性疾病的发生中起着重要作用[4]。CIA模型的症状和病理特征与人类RA相似，被广泛用于研究RA的发病机制及筛选治疗RA的药物[5]。本文选用大鼠CIA模型模拟人类RA，以CD4+CD25+Tregs为研究对

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