金丝桃素粉剂对人工感染传染性囊病病毒鸡的疗效试验

尚若锋，刘 宇，陈炅然，郭文柱，郭志廷，梁剑平

（中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050）

鸡传染性囊病（IBD）是由鸡传染性囊病病毒（IBDV）引起的是一种免疫抑制性、急性和高度接触性的传染病。该病毒主要侵害4～6周龄鸡的腔上囊，破坏其中正在分化成熟的B淋巴细胞，使病鸡更易感染新城疫、马立克病和传染性支气管炎等疾病，从而引起鸡的急性发病甚至死亡。最初由IBD引起的鸡死亡率较低，目前由于病毒的变异，某些强毒株可使感染雏鸡的发病和死亡率都高达100%，因此本病己成为危害世界养禽业最严重的传染病之一［1］。

金丝桃素（Hypericin）是从贯叶连翘中提取的一种极具抗病毒的活性成分［2］。金丝桃素在抗肿瘤和抗病毒的方面研究比较活跃，尤其对人体免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）有明显的抑制作用［3］。最近的研究表明，金丝桃素对多种畜禽病毒也具有良好的抑制效果，可降低畜禽因病毒性疾病而引起的死亡率［4］。本试验旨在研究金丝桃素粉剂对人工感染引起的传染性囊病的治疗效果，从而为研制新型抗病毒药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验药品 金丝桃素粉剂，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供，由贯叶连翘经过一定的工艺提取加工而成，其中金丝桃素含量为0.3%。高免卵黄抗体，由洛阳普莱柯生物工程有限公司生产（批号：080324）。

1.2 试验毒株 传染性囊病病毒毒株为标准毒株（IBDV BC-6／85），购自中国兽医药品监察所。该毒株BID50为10-5.0／0.1mL，使用时稀释到100BID50／0.1 mL，并加入～IU／mL的青霉素和5120μg／mL链霉素，在-70℃保存待用。

1.3 试验动物和鸡胚 20日龄海蓝褐健康雏鸡，共180只，雌雄各半，购自河北高碑店市种鸡场。在10日龄和15日龄时分别用腔上囊抗体试剂盒检测抗体，剔除抗原阳性者或体弱者。10日龄的SPF鸡胚，共60枚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.4 试验分组及病毒感染 将180只鸡随机分为6组，每组30只。分别为金丝桃素粉剂高、中、低剂量组、高免卵黄抗体对照组、阳性对照组和阴性对照组。除阴性组外，每只鸡均通过点眼感染0.1mL的病毒稀释液。在攻毒前和试验结束后，称重每一组的所有鸡只，计算每组的相对增重率。在试验期间，每天观察各组鸡的精神状态、临床表现及其死亡情况等，计算发病率和死亡率。以上各组鸡均饲养在不同的隔离器中，饲喂不添加任何药物和添加剂的饲料，自由饮水。

1.5 给药剂量及途径 在攻毒48h后，根据金丝桃素粉剂高、中、低剂量组鸡群的重量，将金丝桃素粉剂混入饲料中，并采取一定的措施尽量使所有的鸡只均能采食到混入药物的饲料，剂量分别为1330 mg、667.9mg、333.9mg／kg体重·d。每天集中给药1次，共给药4d。药物对照组根据高免卵黄抗体使用说明书注射给药，剂量为0.5mL／只，间隔1d，共注射2次。阳性对照组和阴性对照组不给任何药物。

1.6 病理剖检观察 试验结束后，对存活的各试验鸡只实施安乐死法处死，剖检后观察腔上囊、肌肉组织（腿肌和胸肌）和肾脏等的病理学变化，并按照观察指标进行记分［5］。腔上囊病变指数=腔上囊出血记分总和／鸡总数。记分标准：腔上囊严重出血记4分，中度出血记3分，轻度记1分，黏膜局灶性发红0.2分。肌肉病变指数=肌肉出血记分总和／鸡总数。记分标准：选择腿肌或胸肌中出血最严重者进行打分，严重出血3分／侧，中度出血2分／侧，轻度出血1分／侧。综合病变指数=腔上囊出血记分总和+肌肉出血记分总和／鸡总数。

1.7 腔上囊组织中病原分离 试验结束后，无菌采取各组鸡的腔上囊，反复冻融3次，磨碎后加灭菌生理盐水作1∶5～1∶10悬液，3000r／min离心10 min，取上清液加入抗生素作用1h。经绒毛尿囊膜接种SPF鸡胚，每枚接种0.2mL，每组10枚，37℃孵育3～5d，观察和记录各组鸡胚的病变和死亡情况［6］。

1.8 数据处理 采用SAS 9.0统计软件进行数据分析，各试验组之间的差异采用邓肯多重比较分析法进行分析。

2 结果

2.1 试验鸡群临床症状与体重变化情况 攻毒后，阳性组大部分鸡出现了典型的传染性囊病症状，如厌食、精神沉郁，个别鸡排出白色或黄色水样粪便等。药物组和高免卵黄抗体组中部分鸡出现程度不同的轻微症状。但均未出现死亡的现象。

在试验前后，分别对每组鸡只进行称重，平均体重见表1。阴性对照组、金丝桃素粉剂中剂量组和阳性对照组之间在试验结束后体重有极显著性差异（P＜0.01），金丝桃素粉剂高剂量组、高免卵黄抗体对照组、低剂量组和阳性对照组之间在试验结束后体重不存在显著差异。

表1 人工感染试验鸡体重的变化情况

2.2 口服金丝桃素粉剂对感染鸡群病理变化的影响 试验结束后，根据每只鸡的腔上囊、肌肉（腿肌和胸肌）出血严重程度对其记分后并计算综合病变指数，结果见表2。阳性对照组的综合病变指数极显著高于其他任何各组（P＜0.01）。低剂量组的综合病变指数显著高于（P＜0.05）高免卵黄抗体对照组。高、中剂量组均极明显低于高免卵黄抗体对照组（P＜0.01）。

2.3 感染鸡群传染性囊病病毒分离结果 将处理后的腔上囊组织液经接种SPF鸡胚，孵育3～5d后，各组的鸡胚死亡率见表3。阳性对照组的鸡胚是100%的死亡，明显高于其他各组，并出现典型的传染性囊病病毒增殖特点。

表2 人工感染传染性囊病病毒后主要脏器的出血病变指数

表3 人工感染后传染性囊病病毒分离结果

3 讨论

本试验中，人工感染传染性囊病病毒后，未出现任何鸡的死亡，但可以造成鸡典型的腔上囊、肌肉和脾脏的出血，以及花斑肾等症状。因此，可以使用病变指数和病原分离，结合临床体重变化，评价药物对该毒株是否具有一定的抑制作用。

金丝桃素具有明显的抗RNA病毒的作用，已试用于艾滋病、肝炎病毒和水痘病毒等感染的治疗中［2］。在病毒复制过程中，金丝桃素不影响病毒的转录和翻译，而是干扰病毒的装配与释放，另外，金丝桃素还能促进机体的免疫功能［4］。金丝桃素粉剂对传染性囊病的治疗作用除了能够直接抑制病毒增殖外，可能与提高鸡的免疫功能也有一定的关系，但具体作用机理还需要进一步的试验验证。

连续口服高剂量的金丝桃素粉剂后，感染鸡群的体重相对于中剂量组稍有下降，但差异不显著，这可能与金丝桃素粉剂的苦涩味道有关，影响了鸡只获得拟定的高剂量药物，从而使得高剂量组的综合病变指数稍低于中剂量组。中剂量组的鸡群体重显著药物对照组和低剂量组（P＜0.01），综合病变指数极显著低于低剂量组和药物对照组（P＜0.01），另外根据病毒分离结果分析，中剂量组能有效抑制病毒的增殖。综上所述，金丝桃素粉剂具有一定的治疗由人工感染引起的传染性囊病的效果，尤其是以667.9mg／kg体重·d（相当于金丝桃素纯品2.0 mg／kg体重），连续口服4d治疗效果较好。

［1］周继勇，李建荣.传染性法氏囊病病毒变异株弱毒的遗传稳定性与免疫原性［J］.中国兽医学报，2000，20（4）：317-320.

［2］Hudson J B，Bazzocchi L，Towers G H N.Antiviral activity of hypericin［J］.Antiviral Res，1991，15：101.

［3］Viletinck A J，DeBruyne T，Apers S，et al.Plant-derived leading compounds for chemotherapy of human immunodeficiency virus（HIV）infection［J］.Planta Med，1998，64（2）：97.

［4］PU Xiuying，LIANG Jianping，SHANG Ruofeng，et al.Influence of Hypericum perforatum Extract on Piglet Infected with Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus［J］.Agricultural Science in China，2009，8（6）：730-739.

［5］卡尔尼克 B W.禽病学［M］.高福，刘文军，译.9版.北京：北京农业大学出版社，1991：427-432.

［6］朱连勤，朱风华，张宗敏，等.中草药制剂对鸡人工感染IBD的防治效果的研究［J］.中兽医学杂志，2002，109（4）：2-4.