东北原生种猕猴桃黄酮类化合物的提取研究

么宏伟，张跃新，谢晨阳，吴洪军，冯磊，赵凤臣，张学义

（黑龙江省林副特产研究所，黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011）

猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属的落叶藤本植物，经济价值较高。我国原产52个种、变种和变型，有经济价值的有9种［1］。东北原生种猕猴桃包括软枣猕猴桃［Actinidia arguta（Sieb.et Zucc.）Planch.］、狗枣猕猴桃［A.kolomikta（Rupr.etMaxim.）Planch.］和葛枣猕猴桃［A.polygama（Sieb.et Zucc.）Miq.］，它们是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）落叶藤本植物，是3种有经济价值的种类。东北原生种猕猴桃作为一种纯天然、绿色、野生的可食用浆果，具有抗发炎、抗病毒、抗氧化、抗癌以及舒张血管等作用，其主要活性成分之一就是黄酮类化合物。

本文主要从以下几方面对东北原生种猕猴桃黄酮类化合物的提取进行研究：（1）采用乙醇提取发处理方法从对提取时间温度、提取时间、乙醇浓度各因素进行研究，确定最佳的工艺；（2）采用超声波技术从超声时间、超声温度、乙醇浓度对东北原生种猕猴桃黄酮类化合物的提取工艺进行了优化；（3）采用超临界CO2萃取法中萃取时间、萃取温度、萃取压力三个因素进行了正交试验和分析，确定CO2萃取的最佳工艺参数；（4）比较4种方法提取率的高低，以及各自的优缺点。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料。市售东北原生种猕猴桃，经过干燥、超微粉碎，贮存于干燥器中。

1.1.2 试剂。蒸馏水：分析纯，市售。无水乙醇：分析纯，质量分数≧99.7%，天津市东丽区天大化学试剂厂。亚硝酸钠：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。硝酸铝：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。芦丁标准品：生化试剂，辽宁省生物医药研发中心。氢氧化钠：分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂。

1.1.3 仪器设备。真空冷冻干燥机LG－5，上海市离心机研究所；高速万能粉碎机FW－100，天津市泰斯特仪器有限公司；电子分析天平AB104－N，梅特勒－托利多仪器上海有限公司；CO2超临界萃取装置，南通市华安超临界萃取有限公司；数控超声波清洗器KQ－100DE，昆山市超声仪器有限公司；电热恒温水浴锅DK－98－1，天津市泰斯特仪器有限公司；低速离心机LD5－2A，北京医用离心机厂；紫外分光光度计UV－2550，日本岛津。

1.2 试验方法

1.2.1 东北原生种猕猴桃黄酮类化合物含量的测定1.2.1.1 标准曲线的制定。准确称取芦丁标准品10mg，用95%乙醇溶解，定容50mL，得到0.2g／L芦丁标准液，备用。按梯度准确吸取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL分别加蒸馏水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的 Al（NO3）3溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，摇匀，放置15min，以吸取0mL芦丁标准液的测试样为空白样调零。于510nm波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标，以芦丁标准品浓度为纵坐标，绘制出标准曲线。

1.2.1.2 猕猴桃黄酮类化合物的测定。吸取提取液1.0mL，加蒸馏水定容至6mL；加入5%的NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的 Al（NO3）3溶液1.0mL，摇匀，放置6min；加入10%的NaOH溶液10mL，摇匀，放置15min，以吸取0mL芦丁标准液的测试样为空白样调零。于510nm波长处测定吸光度。以回归方程计算其浓度。

本研究中将东北原生种猕猴桃黄酮类化合物的提取量定义为1g东北原生种猕猴桃粉末提取出黄酮类化合物的质量，提取液中黄酮类化合物的浓度通过标准曲线回归方程计算得出的，黄酮类化合物提取量的计算公式如下：

提取量（mg／g）＝（C×V）／M

式中：C：提取液黄酮类化合物的浓度（mg／mL），V：提取液的总体积（mL），M：东北原生种猕猴桃粉末的用量（g）。

1.2.2 材料前处理。新鲜野生猕猴桃冷冻干燥，粉碎机粉碎，过筛，备用。

1.2.3 东北原生种猕猴桃黄酮类化合物的提取

1.2.3.1 乙醇提取法的条件确定

（1）提取时间对提取量的影响。准确称取1g猕猴桃粉末，配成乙醇浓度为50%（v／v）的1∶100料液，置于60℃水浴中，分别提取2、3、4、5、6h。

（2）提取温度对提取量的影响。准确称取1g猕猴桃粉末，配成乙醇浓度为50%（v／v）的1∶100料液，分别置于40、50、60、70、80℃水浴中提取4h。

（3）乙醇浓度对提取量的影响。准确称取1g猕猴桃粉末，分别配成乙醇浓度为10%、30%、50%、70%、90%（v／v）的1∶100料液，置于60℃水浴中提取4h。

（4）乙醇提取法最佳提取条件的确定。为得到乙醇提取法的最佳提取条件，采用正交试验设计。以提取时间、提取温度和乙醇浓度为影响因素，以黄酮类化合物提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9（33）进行试验。

表1 乙醇提取法正交因素水平表

1.2.3.2 超声提取法条件确定

（1）超声温度对提取量的影响。准确称取5g猕猴桃粉末，融入100mL乙醇浓度50%（v／v）料液，超声功率100W，时间30min，超声温度分别为20、30、40、50℃。

（2）超声时间对提取量的影响。准确称取5g猕猴桃粉末，溶入100mL乙醇浓度50%（v／v）料液，超声功率100W，超声温度为30℃，超声时间分别为15、30、45、60min。

（3）乙醇浓度对提取量的影响。准确称取5g猕猴桃粉末，溶入100mL乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%（v／v）料液，超声功率100W，时间30min，温度30℃。

（4）超声波提取法最佳提取条件的确定。为得到超声波提取法的最佳提取条件，采用正交试验设计。以超声温度、超声时间和乙醇浓度为影响因素，以黄酮类化合物提取量为指标，采用三因素三水平的正交表L9（33）进行试验。

表2 超声波提取法正交因素水平表

1.2.3.3 超临界CO2流体萃取条件确定

（1）萃取温度对提取量的影响。选择萃取温度分别为40、50、60、70、80℃，萃取压力25MPa，萃取时间2h。

（2）萃取压力对提取量的影响。选择萃取压力分别为15、20、25、30、35MPa，萃取温度70℃，萃取时间2h。

（3）萃取时间对提取量的影响。选择萃取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5h，萃取压力25MPa，萃取温度70℃。

（4）超临界CO2流体萃取最佳提取条件的确定。为得到超临界CO2流体萃取的最佳提取条件，采用正交试验设计。以萃取温度、压力、时间为影响因素，以黄酮类化合物提取量为指标，采用三因素三水平的正交表 L9（33）进行试验。

表3 超临界CO2流体萃取正交因素水平表

2 结果与分析

2.1 乙醇提取法最佳条件结果分析

2.1.1 提取时间对提取量的影响结果

图1 提取时间对提取量的影响

表4 不同提取时间提取量差异显著表

由图1可知，随着提取时间的增加，提取量逐渐增大，达到5h时提取量最高，提取时间大于5h时提取量呈下降趋势。由表4可知，提取5h提取量最多，较其它处理差异显著，因此提取5h提取时间为最佳条件。

2.1.2 提取温度对提取量的影响结果

图2 提取温度对提取量的影响

表5 不同温度时间提取量差异显著表

由图2、表5可知，提取量随着温度的升高而逐渐增加。80℃时提取量最大，较其它处理差异显著。因此在80℃条件下进行提取效果最佳。

2.1.3 乙醇浓度对提取量的影响的影响结果

图3 乙醇浓度对提取量的影响

表6 不同乙醇浓度提取量差异显著表

由图3可知，料液比在10%～50%区间时，提取量随着乙醇浓度的增加而增加，乙醇浓度大于50%时，提取量随着乙醇浓度的增加而减少。由表6可知，乙醇浓度在50%时提取量最高，较其它处理差异显著。因此，最佳乙醇浓度为50%。

2.1.4 正交试验结果

表7 编码水平表

表8 正交试验结果

由正交试验表8可知，三因素极差B＞A＞C，说明影响提取量的主要因素依次为提取温度、提取时间、乙醇浓度。6处理提取量最大，因此乙醇提法最佳提取条件为提取温度80℃、乙醇浓度为60%、提取4h，此条件下可提取0.219OD黄酮。

2.2 超声提取法最佳条件结果分析

2.2.1 超声温度对提取量的影响结果

图4 超声温度对提取量的影响

表9 不同超声温度提取量差异显著表

由图4可知，超声温度在20～40℃时，提取量随着温度的升高而增加，超声温度超过40℃，提取量随着温度的增加而减少。由表9可知，超声温度在40℃时提取量最高，较其它处理差异显著。因此，最佳超声温度为40℃。

2.2.2 超声时间对提取量的影响结果

图5 超声时间对提取量的影响

表10 不同超声时间提取量差异显著表

由图5可知，超声时间在15～45min区间内，提取量随着时间的增加而增加，超声时间大于45min时，提取量随着时间的增加而减少。由表10可知，超声时间在45min时提取量最大，较其它处理差异显著。因此，最佳超声时间为45min。

2.2.3 乙醇浓度对提取量的影响结果

图6 乙醇浓度对提取量的影响

表11 不同乙醇浓度提取量差异显著表

由图6可知，乙醇浓度在40%～60%区间内，提取量随着乙醇浓度的增加而增加，乙醇浓度大于60%时，提取量随着乙醇浓度的增加而减少。由表11可知，乙醇浓度在60%时提取量最大，较其它处理差异显著。因此，最佳乙醇浓度为60%。

2.2.4 超声正交试验结果

表12 编码水平表

表13 正交试验结果

由正交试验表13可知，三因素极差B＞A＞C，说明影响提取量的主要因素依次为超声温度、超声时间、乙醇浓度。7处理提取量最大，因此超声提法最佳提取条件为超声温度30℃、乙醇浓度为60%、超声提取60min，此条件下可提取0.607OD黄酮。

2.3 超临界CO2流体萃取结果

2.3.1 萃取温度对提取量的影响结果

图7 萃取温度对提取量的影响

表14 不同萃取温度提取量差异显著表

由图7可知，提取量随着萃取温度的升高而增加。由表14可知，萃取温度在50℃时提取量最高，较其它处理差异显著。因此，最佳萃取温度为50℃。

2.3.2 萃取压力对提取量的影响结果

图8 萃取压力对提取量的影响

表15 不同萃取压力提取量差异显著表

由图8可知，萃取压力在15～25MPa时，提取量随着萃取压力的升高而增加，萃取压力超过25MPa，提取量随着萃取压力的增加而减少。由表15可知，萃取压力在25 MPa、30MPa时提取量最高，较其它处理差异显著。出于成本考虑，因此，最佳萃取压力在25MPa。

2.3.3 萃取时间对提取量的影响结果

图9 萃取时间对提取量的影响

表16 不同萃取时间提取量差异显著表

由图9可知，提取量随着萃取时间增加而增加。由表16可知，萃取时间在60min、80min、100min时提取量最大，较其它处理差异显著。出于成本考虑，因此，最佳萃取时间为60min。

2.3.4 萃取正交试验结果

表17 编码水平表

表18 正交试验结果

由正交试验表18可知，三因素极差B＞C＞A，说明影响提取量的主要因素依次为萃取温度、萃取压力、萃取时间。8处理提取量最大，因此萃取提法最佳提取条件为萃取温度50℃、萃取压力30MPa、萃取时间100min，此条件下可提取0.345OD黄酮。

2.4 各最佳提取方法比较结果分析

由表19可知，各最佳提取方法的提取量差异显著，提取量依次为超声提取法＞萃取法＞乙醇提取法。因此，超声提取法为最佳提取方法。

表19 不同提取方法提取量差异显著表

3 结论

3.1 乙醇提法最佳提取条件为：提取温度80℃、料液比60%、提取4h，此条件下可提取0.219OD黄酮。

3.2 超声提法最佳提取条件为：超声温度30℃、乙醇浓度为60%、超声提取60min，此条件下可提取0.607OD黄酮。

3.3 CO2萃取提法最佳提取条件为：萃取温度50℃、萃取压力30MPa、萃取时间100min，此条件下可提取0.345OD黄酮。

3.4 最佳提取方法的提取量差异显著，提取量依次为超声提取法＞萃取法＞乙醇提取法。因此，超声提取法为最佳提取方法。

［1］印万芬.我国有经济价值的猕猴桃及其利用［J］.特产科学实验，1981（3）.