半制备液相法红松树皮多酚物质分离技术的研究
2012-08-07黄雨洋王振宇
黄雨洋，王振宇
（1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；2.哈尔滨工业大学 食品科学与工程学院，哈尔滨 150090；3.黑龙江粮食职业学院，哈尔滨 150080）
红松（Pinus koraiensis）亦称果松、海松。常绿乔木，高达40m，叶五针一束，长6～12cm。球果卵状圆锥形，种子大无翅。红松种子长1.2～1.6cm，子叶13至16枚。红松是主要分布于我国东北小兴安岭地区，是重要的农林资源［1－2］。
常与鱼鳞松、红皮云杉等组成混交林。耐旱性强，喜微酸性或中性土，针叶及球果中含有抗氧化活性成分，种子可食，入药后具有祛风除湿、滋养补虚的功效。
近年来，天然抗氧化剂的研究备受关注，其中多酚类是主要的抗氧化活性成分之一，松多酚即是此多酚类的成分之一，具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等多种生物活性［3－4］。研究表明，红松树皮中含有大量的多酚物质，为红松树皮的综合利用、变废为宝提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
红松树皮 采于小兴安岭；甲醇美国TEDIA天地试剂公司，HPLC；三氟乙酸TFA北京迪马科技有限公司，HPLC；去离子水水 杭州娃哈哈有限公司，分析纯。
1.2 实验仪器
制备型高效液相色谱仪 北京创新通恒科技有限公司；超声仪；天津泰斯特仪器公司；AB54型电子天平；梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；0.45μm微孔滤膜；北京化工二厂。
1.3 实验方法
1.3.1 工艺流程
红松树皮→乙醇提取［5］→大孔吸附树脂AB－8（梯度洗脱→选取40%的洗脱→二级纯化（制备型高效液相色谱仪）→各种因素进行对比→结果
1.3.2 红松多酚的一级纯化
首先对大孔吸附树脂AB－8进行预处理：乙醇中浸泡AB－8大孔树脂24h，待其充分溶胀后用蒸馏水反复洗涤，除去树脂表面的残留乙醇至无白色浑浊物出现。然后用8%盐酸浸泡10h，用蒸馏水反复冲洗，用试纸测其pH7.0停止，再用5%氢氧化钠溶液浸泡10h，在用蒸馏水反复冲洗至中性、装柱。用大孔吸附树脂AB－8进行梯度洗脱（20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇）对红松多酚进行一级纯化，由于实验时间的原因，本实验采用40%乙醇洗脱液用半制备型液相进行了二次纯化。
1.3.3 半制备液相色谱法二级纯化红松多酚
1.3.3.1 红松多酚样品的配制。取0.1g经 AB－8型大孔树脂40%乙醇洗脱液的一级纯化冻干粉末溶解于10mL的甲醇溶液中，用0.45μm微孔滤膜过滤备用。
1.3.3.2 半制备液相的色谱条件。色谱柱为北京创新 Daisogel C18－10u100A，P3000 高 压 输 液 泵，UV3000可变波长检测器，柱温25℃下，流量分别为6、8、10mL／min，在紫外线波长分别为280、290、300、308、320、330、340nm下进行，上样量分别为0.25、0.5、0.75、1.0mL，并且在不同的浓度洗脱当中进行分离。
1.3.3.3 试验操作步骤。流动相采用A和B两种，溶剂A：甲醇并混入0.02%三氟乙酸（TFA），溶剂B：去离子水中混入0.02%TFA。溶剂梯度体积比例跟实验要求设定。首先，设定波长、流速，用100%的甲醇对柱子进行清洗。此后采用相同的紫外线波长和流速走基线，流动相采用不同的非线性浓度梯度的混合溶剂洗涤，直至基线平稳方可进样。在出现比较的色谱峰是收集样品，之后清洗色谱柱子。
1.3.3.4 观测结果。根据半制备液相色谱峰型的高低，宽窄，面积，出峰时间可相对比较大致得出析出物质的含量多少，面积较大者则意味着析出物质的含量相对较多，从而可根据不同的因素条件对应的不同峰型面积得出析出该种物质含量最多的最佳各因素条件。
1.3.3.5 最佳工艺条件的研究
（1）流速对出峰面积的影响。在紫外线波长为308nm时，选取进样量为2针（即为0.5mL），采用溶剂梯度体积比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界环境下，分别选取流速为6、8、10mL／min进行试验。选取一流速后1.3.3.4的操作流程获取峰型图。
（2）进样量对出峰面积的影响。在紫外线波长为308nm，流速为8mL／min时，采用溶剂梯度体积比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界环境下，分别选取进样量为1针（0.25mL），2针（0.50mL），3针（0.75mL），4针（1.00mL）进行试验。选取一进样量后1.3.3.4的操作流程获取峰型图。
（3）紫外线波长对出峰面积的影响。在流速为8mL／min，进样量为1针（0.25mL）时，采用溶剂梯度体积比例如下0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B，在相同的外界环境下，分别选取紫外线波长为280、290、300、308、310、320、330、340nm进行试验。选取一紫外线波长后按1.3.3.4的操作流程获取峰型图。
（4）浓度洗脱对出峰面积的影响。在流速为8mL／min，进样量为1针（0.25mL），在紫外线波长为308nm时，在相同的外界环境下，分别选取浓度洗脱：①0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。②0～10min，0A／100B；10～20min，20A／80B；20～30min，40A／60B；30～40min，60A／40B；40～50min，80A／20B；50～60min，100A／0B；60～90min，100A／0B。③0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。④0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，60A／40B；50～60min，70A／30B；60～65min，90A／10B；65～100min，100A／0B。⑤0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B进行试验。选取一紫外线波长后按2.3.2.4的操作流程获取峰型图。
2 结果与分析
2.1 流速对出峰面积的影响
以下试验均进样两针（0.5mL），紫外线波长为308nm，浓度洗脱为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
（1）流速为6mL／min
图1 色谱图
（2）流速为8mL／min
图2 色谱图
（3）流速为10mL／min
图3 色谱图
由图1～3可知在流速为6mL／min时，在77min时出现较大幅度的乱峰可能会导致析出的样品不够纯正含有杂质或含有多种未知物质，此图不能准确反映红松树皮多酚物质分离的效果，故不能使用。在图2与图3中我们可以观察到二者峰型较为相似，流速为10mL／min的波型较好但考虑到流速的增加导致试剂的大量使用，使实验成本增加，故由上述原因选定流速8mL／min为最佳流速。
2.2 进样量对出峰面积的影响
以下试验均为紫外线波长为308nm，流速为8mL／min，浓度梯度为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
（1）选取进样量为一针0.25mL
图4 色谱图
（2）选取进样量为2针0.50mL
图5 色谱图
（3）选取进样量为3针0.75mL
图6 色谱图
（4）选取进样量为4针1.00mL
图7 色谱图
由上述图4～7发现，进样量为一针，两针时的图形较好析出的物质较纯，而进样量增加后峰型不如前者，进样一针和进样两针相比较一针的较好，且用的样品较少可以起到节约样品用量的作用，故选取进样量一针（0.25mL）为最佳进样量。
2.3 紫外线波长对出峰面积的影响
以下试验均为流速为8mL／min，进样量为1针（0.25mL），浓度梯度为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
（1）紫外线波长为280nm
图8 色谱图
（2）紫外线波长为290nm
图9 色谱图
（3）紫外线波长为300nm
图10 色谱图
（4）紫外线波长为308nm
图11 色谱图
（5）紫外线波长为310nm
图12 色谱图
（6）紫外线波长为320nm
图13 色谱图
（7）紫外线波长为330nm
图14 色谱图
（8）紫外线波长为340nm
图15 色谱图
由以上图8～15可分析到紫外线波长才280nm时，最高峰出叉，证明该峰中不仅只含有一种物质，可能还含有两种以及两种以上物质，故此波长不予采用。紫外线波长在290nm、300nm、310nm、320nm时均有杂质峰的出现并且出峰时间长试剂用量大，故不予使用。紫外线波长为330nm、340nm时峰型较宽含有过多较大的杂质峰，析出样品量不够理想故不予使用，综上所述，选取波长为308nm为最佳波长。
2.4 浓度洗脱对出峰面积的影响
以下试验均在流速为8mL／min，进样量为1针（0.25mL），在紫外线波长为308nm时完成。
（1）浓度洗脱为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
图16 色谱图
（2）浓度洗脱为0～10min，0A／100B；10～20min，20A／80B；20～30min，40A／60B；30～40min，60A／40B；40～50min，80A／20B；50～60min，100A／0B；60～90min，100A／0B。
图17 色谱图
（3）洗脱浓度为0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
图18 色谱图
（4）洗脱浓度为0～10min，0A／100B；10～40min，10A／90B；40～50min，60A／40B；50～60min，70A／30B；60～65min，90A／10B；65～100min，100A／0B。
图19 色谱图
（5）浓度洗脱为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，50A／50B；50～60min，70A／30B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
图20 色谱图
由上述图16～20可分析可知图18、图20出峰时间较长，试剂使用较多故不予使用。图17、图19有过多杂质峰，且杂质峰的波动较大对析出物质的纯度影响较深，故不予使用。因此可得出浓度洗脱为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B为最佳浓度洗脱。0～10min，0A／100B。
3 结论
通过单因素试验得出利用半制备液相法对红松树皮多酚物质分离的最佳工艺条件为：流速为8mL／min，进样量为一针（0.25mL），紫外线波长为308nm，浓度洗脱为0～10min，0A／100B；10～40min，20A／80B；40～50min，60A／40B；50～60min，65A／35B；60～65min，95A／5B；65～100min，100A／0B。
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