氧化苦参碱抑制脂多糖所致小胶质细胞炎性因子分泌的实验研究

董晓巧 杜 权 俞文华 张祖勇 朱 强 车志豪 陈 锋 王 昊 陈 军杭州市第一人民医院 杭州 310006

氧化苦参碱是从豆科植物苦参、苦豆子等中分离出来的生物碱，属于四环的喹嗪啶类，具有抗炎作用[1-3]。但有关氧化苦参碱对体外培养小胶质细胞炎性因子分泌的影响研究少见报道。本研究观察氧化苦参碱对脂多糖所致小胶质细胞白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）分泌的影响，从细胞水平探讨氧化苦参碱的抗炎作用。

1 材料与方法

1.1 材 料 BV-2细胞购自中国医学科学院协和医科大学基础医学细胞中心，氧化苦参碱购自陕西慧科植物开发有限公司，脂多糖购于美国sigma公司，IL-1β、TNF-α 和 IL-6 ELISA 试剂盒购自美国R&D systems公司。

1.2 分 组 设对照组、药物组、脂多糖组及氧化苦参碱小、中、大剂量组，按 30 min、1 h、3 h 和 6 h 四个时间点分设4个亚组。对照组为BV-2细胞常规培养，药物组为BV-2细胞常规培养加氧化苦参碱培养（氧化苦参碱终浓度为20 μg/mL），脂多糖组为BV-2细胞常规培养加脂多糖培养（脂多糖终浓度为1 μg/mL），小、中、大剂量组为 BV-2 细胞常规培养加小、中、大剂量氧化苦参碱培养（氧化苦参碱终浓度为 1、10、20 μg/mL）30 min，再加脂多糖培养（脂多糖终浓度为 1 μg/mL）。

1.3 细胞培养 细胞接种于血清灭活的DMEM培养液（含10%胎牛血清，1×105IU/L青霉素，l00 g/L链霉素），置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每2～3天更换新鲜培养液，传代培养。将BV-2细胞按每孔2×104个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔体积200μL，每组设定6个重复孔，镜下观察，待细胞进入对数生长期，弃去孔内陈旧培养液，加入无血清的新鲜DMEM培养液培养2h使细胞周期同步化。按分组要求加入相应DMEM培养液，依次培养30 min、1 h、3 h 和 6 h。

1.4 指标检测 在对应时间点，吸取各组每孔上清液，以12 000 r/min离心5 min，提取细胞上清液，于-70℃内保存备用。根据ELISA试剂盒说明书测定上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6蛋白的浓度。

1.5 统计学方法 使用SPSS 11.0软件进行统计分析，数据用（±s）表示，多组比较采用方差分析，两组间比较采用LSD法。

2 结果

2.1 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞IL-1β 分泌的影响 在30 min、1 h、3 h和6 h四个时间点，对照组细胞培养上清液中IL-1β浓度与药物组比较差异无统计学意义（P＞0.05），脂多糖组IL-1β浓度显著高于对照组（P＜0.05），氧化苦参碱小剂量组白介素-1β浓度与脂多糖组比较差异无统计学意义（P＞0.05），氧化苦参碱中剂量组IL-1β浓度显著低于脂多糖组（P＜0.05），氧化苦参碱大剂量组白介素-1β浓度显著低于氧化苦参碱中剂量组（P＜0.05），见表1。

表1 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞IL-1β分泌的影响（±s） pg/mL

表1 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞IL-1β分泌的影响（±s） pg/mL

注：与对照组比较，*P＜0.05；与脂多糖组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较，△P＜0.05

组 别对照组药物组脂多糖组小剂量组中剂量组大剂量组n/孔666666 30min 28.0±4.2 26.3±3.9 142.7±6.7*138.3±5.6 98.0±4.9▲70.2±4.0△1 h 29.0±4.9 27.3±5.6 414.3±8.8*407.2±10.3 306.3±8.4▲274.2±7.3△3 h 27.3±4.7 26.0±3.4 508.3±11.5*499.3±8.5 348.2±6.7▲297.2±5.8△6 h 27.1±4.9 26.7±4.4 266.3±9.9*265.0±7.2 205.7±8.2▲176.3±7.3△

2.2 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞TNF-α分泌的影响 在30 min、1h、3h和6h四个时间点，对照组细胞培养上清液中TNF-α浓度与药物组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），脂多糖组TNF-α浓度显著高于对照组（P＜0.05），氧化苦参碱小剂量组TNF-α浓度与脂多糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），氧化苦参碱中剂量组TNF-α浓度显著低于脂多糖组（P＜0.05），氧化苦参碱大剂量组TNF-α浓度显著低于氧化苦参碱中剂量组（P＜0.05），见表2。

表2 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞肿瘤TNF-α分泌的影响（±s） pg/mL

表2 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞肿瘤TNF-α分泌的影响（±s） pg/mL

注：与对照组比较，*P＜0.05；与脂多糖组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较，△P＜0.05

6 h 244.7±22.4 254.3±21.2 1752.3±110.3*1697.3±117.6 1354.6±122.7▲862.1±95.4△组 别对照组药物组脂多糖组小剂量组中剂量组大剂量组n/孔666666 30 min 257.3±22.5 242.3±19.1 1424.0±67.8*1395.7±51.2 981.3±68.5▲665.7±58.6△1 h 260.7±21.8 248.7±24.6 2139.0±89.4*2167.7±68.9 1770.0±99.1▲1113.2±90.7△3 h 250.0±21.8 259.8±19.4 2785.2±151.5*2724.0±129.7 1965.3±136.3▲1482.7±124.5△

2.3 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞IL-6分泌的影响 在30 min、1 h、3 h和6 h四个时间点，对照组细胞培养上清液中IL-6浓度与药物组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），脂多糖组IL-6浓度显著高于对照组（P＜0.05），氧化苦参碱小剂量组IL-6浓度与脂多糖组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），氧化苦参碱中剂量组IL-6浓度显著低于脂多糖组（P＜0.05），氧化苦参碱大剂量组IL-6浓度显著低于氧化苦参碱中剂量组（P＜0.05），见表3。

表3 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞白介素-6分泌的影响（±s）pg/mL

表3 氧化苦参碱预处理对脂多糖所致小胶质细胞白介素-6分泌的影响（±s）pg/mL

注：与对照组比较，*P＜0.05；与脂多糖组比较，▲P＜0.05；与中剂量组比较，△P＜0.05

6 h 376.2±70.6 370.6±61.7 4632.2±200.7*4445.5±266.6 2755.5±288.5▲2070.3±182.8△组 别对照组药物组脂多糖组小剂量组中剂量组大剂量组n/孔666666 30 min 383.8±52.2 365.5±56.2 2110.5±99.1*2062.2±73.2 1425.7±72.2▲1092.2±83.9△1 h 406.5±50.8 380.5±56.2 6185.5±130.5*6142.2±164.1 4125.5±149.3▲2795.5±134.5△3 h 381.2±50.1 360.5±48.4 7928.8±192.9*7815.7±132.9 5253.8±146.4▲3363.8±168.9△

3 讨论

小胶质细胞在中枢神经系统具有保护和损害的双重作用，活化的小胶质细胞一方面通过吞噬清除病原体和细胞碎片保护神经元，另一方面通过分泌一系列炎性因子如IL-1β、TNF-α和IL-6等产生细胞毒效应[4-6]。因此，抑制小胶质细胞活化可对神经系统损伤起到一定的保护作用。

氧化苦参碱是从豆科植物苦参、苦豆子等中分离出来的生物碱，属于四环的喹嗪啶类，其化学分子式是C15H24N20，为白色针形棱柱形晶体或白色结晶性粉末，无臭、味苦，具有抗肝炎病毒、抗心律失常、抗癫痫，抗肝、肾和心脏纤维化、抗肿瘤等作用[7-12]。氧化苦参碱具有重要的抗炎作用，可作用于非特异性的炎症反应，它的抗炎作用无需依赖垂体-肾上腺皮质系统；氧化苦参碱具有双向调节的抗炎作用，低浓度时可刺激淋巴细胞增生，高浓度时则抑制淋巴细胞增生[13]。

氧化苦参碱也具有中枢神经系统抗炎作用，可降低脑组织核因子-κB水平，抑制神经系统炎症反应，从而减少局灶性脑缺血大鼠的脑梗死面积[14]；可通过抑制12/15-脂氧合酶介导的丝裂原活化蛋白激酶信号通路从而保护脑缺血大鼠的神经功能[15]。我们既往研究发现氧化苦参碱可通过抑制Toll样受体4/核因子-κB信号途径，减少胶质细胞IL-1β、TNF-α和IL-6释放，从而减少脑外伤大鼠神经细胞凋亡[16]。本研究观察氧化苦参碱对脂多糖所致小胶质细胞IL-1β、TNF-α和IL-6分泌的影响，发现氧化苦参碱剂量依赖性地降低细胞培养上清液中IL-1β、TNF-α和IL-6浓度。研究结果显示，氧化苦参碱对脂多糖所致的小胶质细胞活化具有显著的抑制作用，推测抗炎作用可能是氧化苦参碱神经保护的重要机制。

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