食管鳞癌组织p33/ING1和PTEN蛋白表达的相关性研究

李慧娥 内蒙古自治区呼和浩特市第一医院消化内科 呼和浩特 010020

冷雪芹 内蒙古医学院第一附属医院消化内科

宋光明 内蒙古农业大学职业技术学院

食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发生发展与一些癌基因及其产物的表达密切相关[1]。抑癌基因是正常的细胞基因，它们具有维持细胞正常生长、诱导细胞程序化死亡（凋亡）等功能。这些基因的突变可导致细胞的增殖凋亡失控，增加细胞癌变的可能性[2]。p33/ING1基因是近年来克隆出的抑癌基因，其低表达与人类一些恶性肿瘤的发生、进展有关[3]。PTEN基因是1997年在染色体10q23上克隆出的肿瘤抑制基因[4]。在细胞周期调控、细胞骨架重组、信号传导和肿瘤细胞浸润中起重要作用[5]。p33/ING1、PTEN基因的失活将失对细胞生长的负调节作用，这可能是导致肿瘤发生发展的机制之一。

1 材料与方法

1.1 材 料 食管鳞癌标本58例，取自内蒙古医学院一附院2006年8月—2008年8月手术切除的标本，有完整的临床资料。其中男41例，女17例，年龄≥60岁33例，＜60岁25例。经病理证实，58例均为食管鳞状细胞癌，其中淋巴结转移20例，无淋巴结转移38例。浸润深度：浅层19例，肿瘤浸润深度在黏膜层、黏膜下层或浅肌层；深层39例，肿瘤浸润深度在深肌层或外膜层。43例癌旁黏膜呈轻—中—重度不典型增生改变。组织学分类：鳞状细胞癌高分化20例，中分化19例，低分化19例。所有患者术前均未接受化疗、放疗及其它治疗。

1.2 方 法 取正常食管黏膜、癌旁食管黏膜及癌组织各1份，并将其充分固定于10%中性福尔马林溶液中，脱水、透明、石蜡包埋，以4μm厚连续切片5张，1张经HE染色，3张进行免疫组化染色，另1张备用。采用免疫组织化学技术联合检测凋亡促进因子P33/ING1、PTEN基因分别在食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及其相应的正常食管黏膜组织中的表达情况。鼠抗人P33 ING1（CAb9）单克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology。鼠抗人PTEN/MMAC1免疫组化单克隆抗体、SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。免疫组化程序严格按照严格按照试剂盒说明书进行操作，用己知的PTEN阳性表达的癌组织作阳性对照，用PBS代替I抗作阴性对照。

1.3 结果判定 参照Bresalier等[6]半定量法判断食管癌组织PTEN表达情况。在光学显微镜下每张切片随机选取切片平展、细胞形态和组织结构清晰的视野，选取5个视野（×40），每个视野计数100个细胞，计算各个视野中的阳性细胞的平均百分率作为该切片阳性细胞的百分率，阳性细胞阴性计0分，阳性细胞＜30%计1分，阳性细胞30%～70%计2分，阳性细胞＞70%计3分；同时染色强度亦进行打分，以多数呈现的染色特征为计分标准：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；最后以阳性细胞百分率计分和染色强度计分相加所得的总分进行结果判定：0分为阴性，1～6分为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计数资料采用χ2检验，相关性检验用Spearman相关分析，显著性水准α=0.05。

2 结果

2.1 三种食管组织P33/ING1及PTEN表达情况 见表1、图1～6（见封三）。

表1 三种食管组织p33/ING1及PTEN表达情况 例

2.2 食管鳞癌组织PTEN、p33/ING1表达相关性 35

例PTEN阳性表达的食管癌标本中有19例p33/ING1呈阳性表达，23例PTEN阴性标本中仅有5例p33/ING1呈阳性表达，即PTEN蛋白阳性表达的食管癌标本中p33/ING1蛋白阳性表达率也高，PTEN蛋白阴性表达的食管癌标本中p33/ING1蛋白阳性表达率也低。PTEN与p33/ING1呈现显著正相关（r=0.985，P＜0.05）。

3 讨论

INGI基因是Garkavtsev等[3]采用cDNA消减杂交方法，并结合体内选择技术成功地克隆出的一种抑癌基因。p33/ING1对p53功能的发挥起明显抑制作用[7]。Helbing[8]等发现降低内源性p33/ING1含量可使细胞获得抗死亡能力，阻止凋亡，促使肿瘤形成，而增加p33/ING1含量可增加细胞凋亡的敏感性，证实p33/ING1有促细胞凋亡的作用。Tokunage等[9]发现癌组织中p33/ING1mRNA表达明显低于正常组织。Oki等[10]检测了20例胃癌及相应正常组织，结果显示15例胃癌组织中p33/ING1mRNA表达水平明显下降。本研究中绝大部分正常上皮细胞为阳性表达，而癌组织中大部分为阴性表达，p33/ING1阳性表达率从正常上皮到不典型增生至癌组织逐渐降低，其中正常黏膜与不典型增生组p33/ING1阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。癌组织p33/ING1阳性表达率显著低于正常黏膜中的阳性表达率（P＜0.01）。本实验结果表明，p33/ING1蛋白的改变在食管黏膜的增殖细胞的恶性转换中起重要作用，其机制可能与抑制细胞生长、迁移、铺展和局部黏附、促进血管形成，诱导细胞凋亡等因素有关，癌组织有较多的细胞逃逸p33/ING1蛋白的控制而自主生长，p33/ING1通过下调表达减弱了对癌细胞的生长抑制和凋亡控制，从而参与食管癌的发生发展。因此，检测p33/ING1具有重要的实用价值，可以作为食管癌有效的生物学标志和预后预测指标。

PTEN在恶性肿瘤主要通过基因的突变、缺失或甲基化而失活，PTENmRNA或蛋白表达减低，甚至不表达。目前发现 PTEN在前列腺癌、乳腺癌、肺癌等[11]多种肿瘤细胞株中有表达缺失和突变。本研究发现食管浸润癌组织中PTEN阳性表达率60.34%，显著低于正常食管黏膜组织和癌旁不典型增生组织的阳性表达率（P＜0.05）。本组结果显示，PTEN广泛表达于上皮细胞，而食管癌又是主要来源于食管鳞状上皮的癌症，PTEN在食管癌变过程中有表达缺失现象，使细胞在增殖过程中丧失负调控作用而过度增殖，以致细胞发生癌变。说明PTEN基因失活导致细胞异常增生癌变，且其肿瘤恶性程度较高，易出现浸润和转移。

本组结果显示，p33/ING1和PTEN阳性表达从正常食管黏膜组织到癌旁不典型增生组织再到食管鳞癌组织呈逐渐降低之势。p33/ING1和PTEN在食管鳞癌中的阳性表达率分别为41.37%和60.34%，当肿瘤出现转移时，PTEN阳性表达率显著降低，p33/ING1阳性表达率也显著降低，二者呈正相关（P＜0.05）。肿瘤恶性程度越高，肿瘤转移的可能性也越高，同时，PTEN蛋白的阳性表达率显著降低，这可能与PTEN的阳性表达更为敏感有关。PTEN、p33/ING1基因的失活将失去对细胞生长的负调节作用，这可能是导致肿瘤发生发展的机制之一。

p33/ING1和PTEN在食管鳞癌组织中表达的关系，提示多因素参与了食管鳞癌的发生发展和浸润转移，p33/ING1和PTEN在食管鳞癌的分化和转移中可能起了协同作用，综合检测意义较大，一方面可以提示肿瘤侵袭转移的原因，判断预后；另一方面可以根据其表达的意义选择化疗方案。

[1]Ewan G，Littlewood T.A matter of life and cell death[J].Seienee，1998，281（5381）：1317-1322．

[2]Park YN，Chae KJ，Kim YB.Apoptosis and proliferation.ihepatocarcino-genesis elated to cirrhosis[J].Cancer，2001，92（11）：2733-2738．

[3]Garkevtsev I，Kazarov A，Gudkov A，et al.Suppression of the novel growth inhibitor P33/ING1 promotes neoplastic transformation[J].Nature Genet，1996，14：415-420．

[4]LI j，Yen C，Liaw D，et al.PTEN，a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer[J].Science，1997，275（5308）：1943-1947．

[5]Weng L，Brown J，Eng C.PTEN induced apoptosis and cell cycle arrest through phosphoinsito1-3-kinase/Akt-depen-dent and independent pathways[J].Hum Mol Genet，2001，10（3）：237-242．

[6]Bresalier RS，Ho SB.Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis[J].Gastroetrology，1996，110（5）：1354-1367.

[7]Garkavtsev I，Grigorian LA.The candidate tumor suppression ING1 cooperates with P53 in cell growth control[J].Nature，1998，391（6664）：295-298．

[8]Helbing CC，Veillette C，Riabowol K，et al.Anovel candidate tumor suppressor ING1 is involved in the regulation of a poptosis[J].Cancer Res，1997，57（7）：1255-1258．

[9]Tokunage E，Maehara Y，Oki E，et al.Diminished expression of ING1 mRNA and the correlation with p53 expression in breast cancer[J].Cancer Lett，2000，152（1）:15．

[10]Oki E，Maehara Y，Tokunage E，et al.Reduced expression of p33/ING1 and the relationship with p53 expression in human gastric cancer[J].Cancer Lett，1999，147（1-2）:157．

[11]Kulke MH，Odze RD，Thakore KS，et al.Allelic loss of 10q23，the PTEN tumour suppressor gene locus，in Barrett's oesophagus-associated adenocarcinoma[J].Br J Cancer，2001，84（6）：748-753．