微弧氧化镁合金对兔骨骼肌细胞黏附和增殖的影响

张 涛，尹庆水，夏 虹，张 余，李 梅，杨小明，蓝国波

镁合金是一种新型可降解金属材料，具有良好的降解性和生物相容性[1]，但其降解速度较快，临床应用受到一定限制。微弧氧化（microarc oxidation，MAO）处理可使镁合金表面形成粗糙面，有利于成骨细胞吸附，耐蚀性能也明显改善[2-3]。本研究试图通过观察MAO镁合金、镁合金、钛合金对骨骼肌细胞黏附及增殖影响的比较研究，以评价MAO镁合金材料的生物相容性。

1 材料与方法

1.1 实验动物

日本大耳兔3只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄不限，购于广东省医学实验动物中心。

1.2 主要试剂和试件材料

DMEM培养基、PBS、胎牛血清和胰蛋白酶（美国Hyclone公司）；碘化丙啶染色剂（江苏碧云天公司）；CCK-8（日本同仁公司）；庆大霉素（广东邦民制药厂有限公司）。医用钛合金、镁合金AZ31B均由中科院金属研究所提供，规格均为直径10 mm、厚3 mm圆片状。

1.3 实验分组及处理

根据材料试件的不同分为3组：（1）对照组：采用医用钛合金，磨平抛光后，丙酮和无水乙醇超声清洗，消毒后待用；（2）镁合金组：采用镁合金AZ31B，磨平抛光后，丙酮和无水乙醇超声清洗，消毒后待用；（3）MAO组：采用镁合金AZ31B，磨平抛光后，丙酮和无水乙醇超声清洗，进而采用MAO技术（表面打磨平整、脱脂处理、中和、水洗、SIMOXIDE微弧氧化、水洗、干燥、封闭处理[2]），处理后得到MAO镁合金，消毒待用。

1.4 兔骨骼肌细胞培养

无菌条件下取兔臀部肌肉1 cm3，置于冷D-Hank液中，加入104U/L庆大霉素反复冲洗，去除结缔组织，保留肌肉组织，剪成1 mm3左右的小块，按照组织块法[4]置于培养瓶中贴附，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养，2～3 d换液1次，细胞长至80%融合时进行传代。

1.5 浸提液的制备

根据ISO 10993医疗器械生物学评价标准[5]，按照材料表面积/浸提介质为1.25 cm2/mL的比例，向装有镁合金及MAO镁合金材料的容器中加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，在37℃、5%CO2培养箱中孵育、浸泡24 h，获得镁合金提取液和MAO镁合金提取液，4℃冷藏，24 h内使用。

1.6 细胞黏附率的测定

取3块24孔培养板，分别在每块板中放置18枚材料试件，每组6枚；将兔骨骼肌细胞以1×105/孔接种于24孔板，于37℃、5%CO2培养箱内培养2、6、24 h；各取出1块培养板，PBS漂洗3次，吸净液体，0.25%胰蛋白酶1.0 mL消化1 min；加入含血清的培养基1.0 mL终止消化，1000 r/min离心5 min，吹打制成细胞悬液。使用细胞计数板进行计数，取平均值，计算黏附率，每组设6个复孔。细胞黏附率（%）=已贴壁细胞数/接种细胞总数×100%。

1.7 细胞相对增殖率的测定

0.25 %胰蛋白酶消化兔骨骼肌细胞，取1×104/L细胞悬液200 μL接种于96孔板中，于37℃、5%CO2培养箱内培养24 h。镁合金组、MAO组分别将培养液更换为镁合金浸提液和MAO镁合金浸提液；对照组则加入高糖DMEM培养基，2 d更换1次。分别培养1、3、5、7 d，PBS清洗后加入20 μL CCK-8试剂，继续培养2 h，酶联免疫检测仪测定450 nm处吸光度（optical density，OD），每组设6个复孔，计算相对增殖率。细胞相对增殖率（%）=试验组OD值/对照组OD值×100%。根据细胞增殖率进行毒性评级[6]：0级：100%；1级：80%～99%；2级：50%～79%；3级：30%～49%；4级0～29%。

1.8 细胞凋亡的检测

将1×106/L的细胞悬液2 mL接种于6孔板中，培养24 h；镁合金组、MAO组分别将培养液更换为镁合金浸提液和MAO镁合金浸提液；对照组加入高糖DMEM培养基；分别培养3 d后，加入0.25%胰蛋白酶，将细胞消化成为单细胞悬液；加入1 mL冰浴预冷的乙醇，4℃过夜，1000 g离心4 min沉淀细胞，吸除上清；加入1 mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞；再次离心后，加入碘化丙啶染色剂，37℃避光孵育30 min，流式细胞仪488 nm处进行测定。

1.9 统计学分析

应用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t检验或Bonferroni法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组细胞黏附率的测定结果

培养2、6、24 h时，3组细胞黏附率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中MAO组与对照组、镁合金组各时相点细胞黏附率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组细胞黏附率呈时间依赖性增加（P＜0.05）。见表1。

2.2 3组细胞相对增殖率的比较结果

培养后1、3、5、7 d，3组细胞相对增殖率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；其中MAO组细胞相对增殖率高于镁合金组（P＜0.05），但与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在不同时相点，镁合金组细胞相对增殖率呈时间依赖性下降（F=12.385，P=0.000）；而MAO组细胞各时相点相对增殖率比较，差异无统计学意义（F=1.197，P=0.332）。见表2。

镁合金组毒性评级为2级；MAO组毒性评级为1级，具有良好的生物相容性。

2.3 3组细胞凋亡检测结果

流式细胞仪检测结果表明，对照组和MAO组细胞未见明显凋亡，无明显细胞毒性；而镁合金组可见部分细胞出现凋亡，提示镁合金存在部分细胞毒性。见图1。

表1 不同时相点3组细胞黏附率的比较结果（±s，%）

表1 不同时相点3组细胞黏附率的比较结果（±s，%）

注：*与对照组比较，P＜0.05；#与镁合金组比较，P＜0.05。

组别对照组镁合金组MAO组F值P值2 h 26.46±2.3323.88±2.9031.79±1.71*#18.4920.0006 h 33.92±2.2628.75±2.46*39.75±1.56*#41.4050.00024 h 47.21±2.1136.79±1.66*55.25±1.69*#162.7790.000 F值86.399292.739140.238 P值0.0000.0000.000- -- -

表2 不同时相点3组细胞相对增殖率的比较结果（±s，%）

表2 不同时相点3组细胞相对增殖率的比较结果（±s，%）

注：*与对照组比较，P ＜0.05；#与镁合金组比较，P ＜0.05。

组别对照组镁合金组MAO组F值P值1 d 10083.1±1.2*98.0±2.2#242.6510.0003 d 10081.6±1.0*97.3±1.1#810.6705 d 10079.1±1.0*96.1±2.1#410.51607 d 10078.9±2.8*97.0±2.5#166.870

3 讨论

3.1 镁合金的优缺点

钛合金是目前临床上最常用的骨科植入材料，具有良好的生物相容性，但存在被人体吸收的可能性，术后患者需接受二次手术取出内固定。因此，寻找一种可降解吸收的植入材料成为当前骨科研究领域的热点之一。

镁合金是近年来新兴的一种可降解金属材料，作为骨科植入材料具有其他金属难以比拟的优点：（1）密度为1.74 g/cm3左右，与人的密质骨密度（1.75 g/cm3）基本相当；（2）比强度和比刚度高，镁合金的杨氏模量约为45 GPa，接近人骨20 GPa左右的弹性模量[7]，可避免应力遮挡效应；（3）镁是人体内仅次于钙、钠和钾的常量元素（成人每人每日需要量超过350 mg），与神经、肌肉及心脏功能关系密切[8]。但镁合金的腐蚀破坏速度较快，难以满足临床要求[9]，这成为限制其临床应用的主要瓶颈。为进一步减缓镁合金降解速度，学者们探索了一系列镁合金表面的处理方法，如电化学电镀、化学转化、阳极氧化、气相沉积、激光表面改性和有机涂层等[10-11]，其中MAO作为一种新型的金属表面处理技术，近年来得到材料学及医学界的广泛关注。

3.2 MAO镁合金的优点

MAO是一种在有色金属表面原位生成氧化膜的新技术。该技术将铝、钛、镁等金属置于电解质溶液中，在热化学、等离子化学和电化学的共同作用下，使材料表面产生火花放电生成陶瓷层。MAO技术可显著提高上述材料的耐蚀性、耐磨性和硬度，目前已被广泛应用于航空、航天、机械、电子、纺织、装饰等领域[2]。同时，MAO也是一种很有前景的医用金属植入体表面生物改性技术，已成功应用于钛种植体表面[12]。

与其他表面处理方法相比较，MAO技术的综合性能更加适合于生物医用环境中镁合金的表面处理。它具有以下几个优点：（1）耐腐蚀、耐磨性能更好；（2）与基体结合紧密、不易脱落；（3）可在金属表面形成粗糙面，有利于成骨细胞吸附；（4）与通常的阳极氧化处理相比，对材料的疲劳强度影响较小[3]。黄震等[13]的研究结果显示，经MAO技术处理后的AZ9lD镁合金具有良好的成骨细胞相容性，有利于MG63细胞的早期黏附。柳麟翔等[14]以钛合金作为对照，将MAO镁合金植入兔股骨，术后4周和12周取材观察材料与骨组织的结合情况，结果表明，MAO AZ91D镁合金具有较好的骨结合性能。亦有学者研究MAO镁合金对人体组织的影响，以明确其是否能够真正进入临床。吴婕等[15]观察经MAO处理的AZ91D镁合金浸提液对口腔黏膜的刺激性，结果表明，MAO镁合金未对组织造成明显的不良刺激反应。苗波和姜德志[16]将MAO镁合金植入动物下颌骨内，动物肝脏和肾脏的病理学检测结果均提示其未造成不良影响。这些结论均证实了MAO镁合金良好的生物相容性。

图1 流式细胞仪检测3组细胞凋亡情况

3.3 MAO镁合金对骨骼肌细胞黏附及增殖的影响

作为四肢骨关节运动的动力装置，骨骼肌对于骨关节运动的意义重大。MAO镁合金植入体内后，除了接触骨骼外，还要接触骨骼肌，这种材料对骨骼肌组织的生物相容性如何，对于骨骼肌细胞黏附、增殖有无影响，目前尚没有准确的结论。有研究结果表明，影响黏附的因素包括材料表面的形貌、粗糙度、表面元素成分及金相结构等[17]，这些影响因素不是孤立存在的，而是共同作用以对材料表面的细胞黏附造成影响[18]。

本研究结果显示，MAO组细胞黏附率高于对照组和镁合金组，说明MAO镁合金的表面可能更适合于骨骼肌细胞的黏附。此外，MAO组细胞增殖率与对照组接近，高于镁合金组；MAO组毒性评级为1级，低于镁合金组的2级毒性；进一步的流式细胞仪检测结果证实，MAO组未见明显的细胞凋亡。这些结果均证实，MAO镁合金降解速度减缓，毒性减弱，生物相容性更加优良。

综上所述，镁合金AZ31B经MAO技术处理后对于兔骨骼肌细胞具有良好的黏附作用，且不影响细胞增殖，这为其在骨科植入材料领域的应用提供了部分理论依据，但MAO镁合金对人骨骼肌细胞的作用还有待于进一步的深入研究。

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