纸层析法分离鉴定柠檬酸

路 敏

（晋中学院 化学化工学院，山西 晋中 030600）

柠檬酸因其无毒、安全、酸味可口等特点，作为酸味剂和抗氧化剂广泛应用于食品与饮料工业.70年代以后，柠檬酸在其他工业领域也得到了广泛应用，特别是在洗涤剂中代替磷酸盐作为增效助剂[1]，在生产无磷洗涤剂中担任了重要角色.

在发酵法生产柠檬酸的研究工作中，柠檬酸的定性、定量测定方法有很多，如纸层析法、薄层层析法、酸碱滴定法、光化学法、分光光度法、色谱法等.酸碱滴定法虽操作简便，但选择性差，有机酸干扰严重；分光光度法需要生物碱分解样品，十分繁琐；色谱法具有较高的灵敏度和选择性，但设备昂贵、测样成本高.本文中采用纸层析法进行定性测定柠檬酸.

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

实验所需主要仪器有：AB104-N型电子分析天平，15cm×30cm层析缸，101-3型干燥箱，79-1型磁力加热搅拌器.

1.2 实验试剂

实验所需主要试剂有：95%乙醇（A.R.）、冰醋酸（A.R.）、甲酸（A.R.）、正丁醇（A.R.）、氢氧化钠（A.R.）、柠檬酸（A.R.）、草酸（A.R.）、苹果酸（A.R.）、溴甲酚绿（A.R.）.

1.3 样品的制备

准确称取0.3g分析纯的柠檬酸，溶解后定容至100mL，即得3g/L的柠檬酸溶液，同样方法配制3g/L的苹果酸、草酸溶液，作为标准溶液.柠檬酸发酵液预处理后所得滤液浓度约为100g/L，将其稀释30倍使用.

2 方法与结果

2.1 滤纸的准备、点样及展开方式

2.1.1 展开滤纸的准备

新华3号层析滤纸，裁成30cm×20cm备用，注意使短边的方向和滤纸的纤维方向一致.在距滤纸的长边一侧2cm处用铅笔划一直线，在该直线上均匀分布各点样点.

2.1.2 点样及展开方式

用铅笔在距滤纸边线2cm左右划一直线（称为原线），线上每隔2cm划一圆点（称为原点）.然后用毛细管吸取样品液点在原点，样品点的直径约为0.3cm～0.5cm，点样量约为 5μg～30μg[2].点样采取少量多次点样，每次点样的位置应完全重合，以免出现斑点畸形现象.

滤纸的展开方式有上行展开法、下行展开法、多向展开法[2]等，论文中采用最常用的上行展开法.

点样后、展开前，先将滤纸与层析缸用配好的展开溶液的蒸汽来饱和，以免造成展开体系的组分发生改变，影响层析效果.

平衡结束后，将滤纸靠近点样点的一端浸入展开剂，展开液面距离原线距离约1cm，开始展开.当展开液到达距离滤纸的另一端1cm～2cm处时，展开结束.

2.2 展开剂配比的确定

据文献报道，用于柠檬酸发酵液分离的展开体系多为正丁醇、甲酸、水按一定比例组成[3].论文中也采用该体系，通过大量的对比实验，逐步调整各物质在体系中的比例，最终确定的展开体系为正丁醇﹕甲酸﹕水﹕冰醋酸＝4﹕1﹕4﹕1（体积比），所得到的纸图谱见图1.

2.3 展开温度的影响

有机相中的含水量改变，溶质的Rf值也相应改变.水在有机相中的溶解度是随温度的变化而变化，所以展层温度的改变会使Rf值有所改变.分别在10℃、20℃与30℃下用同一展开体系进行展开，所得展开效果见图2，图3，图4.

图1 纸层析法分析图谱

图2 10℃下展开纸色谱效果图

图3 20℃下展开纸色谱效果图

图4 30℃下展开纸色谱效果图

通过实验，在10℃下展开耗时4h，展开速度较慢，由图2可以看出，样品斑点位置普遍较低，没有很好地将各物质区分开；相反，在30℃下展开仅需1.5h，展开速度较快，由图4可知，样品斑点位置普遍较高，也没有很好将各物质区分开；在20℃下展开需2h，从图3可得，各样品斑点能够被很好地分离开.

2.4 显色

展开结束后，取出滤纸，自然晾干.用2g/L的溴甲酚绿-乙醇溶液作为显色剂，显色剂中加入0.1mol/L的NaOH调成蓝绿色，用喷雾法进行显色.在喷显色剂时，必须在整张滤纸上喷洒均匀，而且用量要适度，然后在100℃下烘干即可.由于溴甲酚绿遇酸呈黄色、遇碱呈深蓝色，所以得到的纸色谱为蓝色（或绿色）背景下的黄色斑点.

实验中发现该体系并不是十分理想，虽然可以分离各种有机酸，但草酸的拖尾现象比较严重.经过多次试验摸索，最终发现在体系中加入10%（V/V）的冰醋酸后，展开效果得以改善，实验结果见图5.

由图5可以看出，在纸层析图谱中，发酵液中除柠檬酸外，其他杂酸并未出现.但用醋酸钙-醋酸溶液检测，有白色沉淀生成，说明发酵液中有草酸存在.之所以在纸图谱中未发现草酸，究其原因为草酸含量较低，发酵液经过稀释后点样，其中草酸的浓度远远低于纸层析法所能检测的范围，因此未能检测到.

图5 柠檬酸发酵液纸层析法分析图谱

3 结论

通过上述实验可得，对柠檬酸发酵液中所含的主要有机酸可通过纸色谱法进行定性分析.通过多次点样，以配比(体积比)为：正丁醇﹕甲酸﹕水﹕冰醋酸＝4﹕1﹕4﹕1为展开体系，在 20℃下，采用上行展开法展开.然后用2g/L的溴甲酚绿-乙醇溶液显色，100℃下烘干.通过测定样品与标准品的Rf值，可以定性判断样品及其纯度.同时，若样品中含有其它与标准样浓度相近的杂酸，纸层析法可以将各种酸分离开来.

〔1〕彭奇均，孙培东.柠檬酸钠在洗涤剂中的应用及发展前景[J].日用化学工业，1996(4):27-30.

〔2〕周同惠.纸色谱和薄层色谱[M].北京：科学出版社，1989.56-125.

〔3〕陈騊声，徐定邦，沙曼云，等.有机酸发酵生产技术[M].北京：化学工业出版社，1993.1-142.