均匀设计法优选柿叶总黄酮的提取工艺Δ

陈丽，韦敏（1.柳州医学高等专科学校药学教研室，广西柳州545005；.柳州市人民医院药剂科，广西柳州 545005）

柿叶为柿树科柿树属植物柿的新鲜或干燥叶，主要有效成分是黄酮类化合物。柿叶黄酮具有显著的降血压作用，已用于冠心病、心绞痛的治疗，是很有前途的天然降血压药[1]。柿叶中的黄酮类化合物主要以苷类形式存在，传统提取时多采用水、甲醇、乙醇作溶剂，乙酸乙酯作萃取剂，但得率较低。本文用均匀设计法对柿叶黄酮乙醇提取工艺进行改进，为进一步研究和开发柿叶医药保健品提供工艺参考。

1 仪器与试药

722可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；JA1003电子天平（上海天平仪器厂）；RE-52旋转蒸发仪（上海安亭实验仪器有限公司）；WBZ-2微波真空干燥机（贵阳新奇微波工业有限责任公司）；离心沉淀机（上海医用分析仪器厂）；KQ-100DB数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

柿叶（购自广西柳州城站药材综合市场，经中国科学院广西植物研究所韦发南研究员鉴定为真品）；芦丁标准品（南京替斯艾么中药研究所，批号：TCM027-071128，含量：99%）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 柿叶总黄酮的含量测定[2]

2.1.1 标准品溶液的制备 精密称量105℃下干燥至恒重的芦丁标准品10 mg，置于50 mL容量瓶中，加50%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为0.2 mg·mL-1的标准品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取各种工艺制备的样品干燥粉末50 mg，加入50%乙醇定容至100 mL，超声（功率：100 W，频率：40 kHz）溶解30 min，摇匀，静置，冷却至室温，吸取上清液，即得浓度为0.5 mg·mL-1的供试品溶液。

2.1.3 标准曲线的制备 分别精密吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL标准品溶液，置于10 mL容量瓶中，加50%乙醇至10 mL，分别加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，加1%NaOH溶液4 mL，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，在510 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）对检测浓度（c）进行线性回归，得回归方程为c＝0.179 4A－0.002 0（r＝0.998 8）。结果表明，芦丁检测浓度在0.020～0.100 mg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.4 样品含量测定 精密吸取供试品溶液5.0 mL，共5份，分别置于50 mL容量瓶中，按“2.1.2”项下方法操作，得供试品待测液（浓度为0.05 mg·mL-1），分别测定吸光度，根据回归方程计算柿叶总黄酮的含量。

2.2 水提取法提取柿叶总黄酮[3，4]

干燥柿叶粗粉5 g→100 mL蒸馏水浸泡30 min→90℃提取2 h（2次）→合并滤液→离心（3 000 r·min-1）15 min→抽滤→滤液用微波真空干燥浓缩→石油醚萃取2次→水相用乙酸乙酯萃取2次→乙酸乙酯相减压浓缩→干燥，即得。

2.3 乙醇提取法提取柿叶总黄酮[4，5]

干燥柿叶粗粉5 g→100 mL70%乙醇浸泡30 min→80℃回流提取2 h（2次）→合并滤液并减压回收乙醇→离心（3 000 r·min-1）15 min→抽滤→滤液用石油醚萃取2次→水相用乙酸乙酯萃取2次→乙酸乙酯相减压浓缩→干燥，即得。

2.4 均匀设计法优选工艺

2.4.1 柿叶粉碎度的选择 取不同粒度干燥柿叶，在乙醇浓度为50%，提取温度为30℃，超声时间为30 min的条件下考察粒度（10～40、40～80、80～100目）对柿叶总黄酮含量的影响。结果，3种粒度范围下的柿叶总黄酮含量分别为43.66%、51.32%、47.48%，故本研究所取药材为过40～80目的干燥柿叶。

2.4.2 提取方法[6，7]采用碱溶酸沉与超声波相结合的方法。取过40～80目筛的干燥柿叶5 g，根据表1中各水平加入相应浓度和体积的乙醇，用超声设备在相应的时间和温度下提取，滤液用旋转蒸发仪减压回收乙醇，浓缩液加20%NaOH调至相应pH值，搅匀，静置1 h，抽滤，滤液用半倍量的石油醚萃取2次，水相加15%HCl调至相应pH值，搅匀，沉淀0.5 h，离心（3 000 r·min-1）15 min，抽滤，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并3次乙酸乙酯相，减压回收乙酸乙酯，最后干燥得总黄酮。

2.4.3 均匀设计及结果分析 根据预试验选取20%NaOH调pH值（X1）、15%HCl调pH值（X2）、乙醇浓度（X3）、超声温度（X4）、超声时间（X5）、液料比（X6）为考察因素，进行U10×（108）均匀试验，以柿叶总黄酮含量为评价指标，优选柿叶总黄酮提取工艺。因素水平见表1；均匀试验结果见表2。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 均匀试验结果Tab 2 Arrangement and results of uniform design

将表2结果输入均匀分析软件，进行多元二次多项逐步回归，得回归方程为Y＝9.10E+3－727X1+2.81X2－1.39E－2X3+1.21 E－2X4+8.52 E－3X5－161X6，r＝0.989 9，样本容量n＝10，显著性水平α＝0.05，检验值Ft＝24.44，临界值F0.05（6，3）＝8.941，Ft＞F0.05（6，3），回归方程显著。剩余标准差s＝1.08。各影响因素的标准回归系数见表3。

表3 各影响因素的标准回归系数Tab 3 Standardized regression coefficient of each influencing factors

多元回归中，标准回归系数显示，对柿叶总黄酮提取的影响效应依次为HCl调pH值＞NaOH调pH值＞液料比＞超声时间＞超声温度＞乙醇浓度。对各因素进行显著性检验后得知，乙醇浓度、超声温度、超声时间对柿叶总黄酮的提取无显著性影响。依据实际经验，药材超声时间通常在24～40 min能获得最佳提取率，提取温度为40～60℃能保护有效成分，故将乙醇浓度定为70%，超声温度定为30℃，超声时间定为32 min。均匀试验结果显示，用15%HCl调pH值为6，用20%NaOH调pH值为9.78时总黄酮含量最高，这与预试验结果相符。但由于实际操作很难将pH值准确调至9.78，故定NaOH调pH值为10。液料比太小，溶液很快达到溶解饱和而不利于收率的提高；液料比过大，对收率没有较大影响，但溶剂量会大大增加[8]，所以根据回归方程和实际经验，将液料比定为11∶1。综上所述，回归方程各项取值分别为 X1＝10，X2＝6，X3＝70%，X4＝32 min，X5＝30 ℃，X6＝11∶1。

2.4.4 验证试验 按上述优化的工艺制备3批样品，计算得柿叶总黄酮平均含量为68.77%，与回归方程预报值（64.1±2.09）%相近，且RSD＝1.64%（n＝3），说明重复性良好，所选工艺可行。

2.5 不同提取方法比较

按“2.2”、“2.3”、“2.4”项下方法分别提取柿叶总黄酮，计算各种方法下总黄酮含量，对3种方法进行比较，结果见表4。

表4 不同提取方法提取柿叶总黄酮效果比较（n＝3）Tab 4 Comparison of the efficacy of different extraction methods in extracting total flavonoids from persimmon leaf（n＝3）

3 讨论

柿叶黄酮类化合物在碱性环境中易溶，用20%NaOH调pH值为10是让尽可能多的黄酮溶解，防止在回收乙醇时黄酮类化合物随杂质析出而被滤除；用15%HCl调pH值为6的作用是除去杂质的同时让黄酮类化合物游离出来，以利于乙酸乙酯萃取。结果表明，超声波与碱溶酸沉相结合的提取方法优于其他传统方法，得到的总黄酮含量最高。

有资料表明，黄酮类化合物与金属离子形成的络合物的稳定性受温度、光照、pH值等多种因素的影响[9～12]，本研究在试验过程中亦发现，显色后放置较长时间吸光度会下降，引起测定结果有偏差。所以，柿叶总黄酮含量测定应在与Al（NO3）3反应后的2 h内进行。

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