白芷醇提物延缓皮肤衰老与抗氧化作用的相关性研究

王方，王灿（1.解放军第153中心医院药剂科，郑州45004；.河南中医学院药学院，郑州450008）

白芷为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.或杭白芷A.dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根。其性温，味辛，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍、燥湿止带等功效，常用于治疗感冒头痛、疮疡肿痛等病证[1]。除外用可有效治疗黄褐斑[2]、白癜风[3]、痊疮[4]等多种皮肤病外，现代药理研究发现白芷可抑制黑色素生成，具有美白的功效[5]，自先秦以来白芷一直作为祛斑美白药广泛使用[6]。对于白芷延缓皮肤衰老和美白的作用机制，传统中医认为其能通窍行表、祛风散湿、通利血脉，故能长肌肤，润颜色[7]，现多从抑制酪氨酸酶活性等方面进行研究[8]。前期研究表明，白芷具有较明显的体内、外抗氧化活性。而过氧化损伤的元凶——自由基是导致皮肤衰老和疾病的重要因素之一[9]。这提示，抗氧化活性可能是中药白芷延缓衰老和美白的作用机制。本文采用体内、外研究相结合的方法，从抗氧化活性方面对中药白芷抗皮肤衰老作用机制进行探讨。

1 仪器与材料

1.1 仪器

BS210S型分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）；微量移液器（上海求精生化试剂仪器有限公司）；UV1000型紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）；RT-MR2100型匀浆机（瑞士KinematicaAg公司）。

1.2 试药

白芷药材购自河南省药材公司，经河南中医学院陈随清教授鉴定为真品。维生素C（湖北华中药业有限公司，批号：20091181）；七宝美髯丸（佛山德众药业有限公司，批号：09002）；D-半乳糖（上海恒信化学试剂有限公司，批号：20100926）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·，美国Sigma公司）；超氧阴离子自由由基（O2－）测试盒、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Hyp）、脂褐素（LF）、羟自由基（·OH）试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供；其余试剂均为分析纯。

1.3 动物

清洁级昆明种小鼠，♀♂兼半，体重（20±2）g，由河北省实验动物中心提供（动物使用合格证号：804186）。

2 方法

2.1 白芷醇提物的制备

白芷粉碎，过50目筛，加10倍量75%乙醇回流2次，每次1.5 h。混合提取液，置旋转蒸发器中浓缩，计算收率后，制备成1 000 mg·mL－1生药浓度的母液，贮藏，备用。

2.2 DPPH·清除能力的测定[10]

试验以维生素C作阳性对照。精密称取20 mg DPPH·，用无水乙醇溶解并定容于250 mL量瓶中，DPPH·溶液浓度即为20 mmol·L－1，4℃避光保存。加样于具塞试管中，充分混匀，室温避光静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度。按下式计算DPPH·的清除率（P）：P＝[1－（Ai－Aj）/Ac]×100%（式中，Ac为DPPH·溶液与溶剂混合液的吸光度，Ai为DPPH·溶液与供试品溶液的吸光度，Aj为供试品溶液与溶剂混合液的吸光度）。试验重复3次，求平均值，计算半数有效量（ED50）。DPPH·加样量见表1。

表1 DPPH·加样量Tab 1 Added amount of DPPH·

2.3 O2-清除能力的测定

采用超氧阴离子自由基测试盒，模拟人体黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶反应体系产生O2-。反应如下：

按照测试盒说明进行加样，充分混匀，于37℃恒温水浴40 min，加入2 mL显色剂，混匀，静置10 min，双蒸水调零，测定550 nm波长处的吸光度A550。待测液对O2-的抑制率＝（对照管A550－测定管A550）/对照管A550×100%。

2.4 OH·清除能力的测定

采用OH·试剂盒，以Fenton反应体系产生OH·，反应如下：

按照测试盒说明进行加样，混匀后于37℃反应1.0 min。分别加入2 mL显色剂，室温放置20 min，双蒸水调零，测定550 nm波长处的吸光度A550。待测液对OH·的抑制率＝（对照管A550－测定管A550）/对照管A550×100%。

2.5 体内实验分组与给药

小鼠60只，♀♂兼半，随机分成6组，即空白对照、模型、七宝美髯丸（3.0 mg·10 g－1）和白芷醇提物高、中、低剂量（6.0、3.0、1.5 mg（生药）/10 g）组。空白对照组每只小鼠按0.1 mg·10 g－1ip 1%D-半乳糖水溶液，1 h后各给药组小鼠按0.2 mg·10 g－1ig给药，空白对照和模型组用生理盐水代替，连续42 d。末次给药2 h后处死小鼠，取标本进行各项指标的测定。

2.6 皮肤匀浆的制备

取脱毛皮肤组织0.6 g，经预冷生理盐水漂洗，除去皮下脂肪和其它结缔组织，滤纸拭干，称重，取该组织块9倍重量生理盐水制成10%组织匀浆。

2.7 皮肤匀浆指标的测定

皮肤匀浆中SOD活性和Hyp、MDA、LF含量均根据测试盒所附方法、步骤进行测定；皮肤含水量的测定采用烘干法：1.0 g脱毛皮肤，精密称取湿重后80℃烘干12 h，称其干重，计算皮肤含水量。

2.8 统计学方法

数据分析采用SPSS13.0 for Windows软件包，计量资料，组间比较采用单因素方差分析，各数据用±s表示，以P＜0.05表示差异有显著性。对多指标间进行多元相关分析。

3 结果

3.1 白芷醇提物对DPPH·、O2-、OH·3种自由基的清除作用

对DPPH·、O2-、OH·3种自由基的清除作用，白芷醇提物的ED50分别为1.96、89.14、114.05 mg·mL－1，维生素C的ED50分别为0.14、50.06、121.60 mg·mL－1，前者分别是后者的0.07、0.56、1.07倍，表明白芷醇提物对DPPH·、O2-的清除作用比维生素C弱，但对OH·自由基清除作用与维生素C相当。白芷醇提物、维生素C对3种自由基的清除作用分别见图1～图3。

图1 白芷醇提物、维生素C对DPPH·的清除作用Fig 1 Scavenging effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix and vitamin C on DPPH·

图2 白芷醇提物、维生素C对O2-的清除作用Fig 2 Scavenging effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix and vitamin C on O2-free radical

3.2 白芷醇提物对衰老模型小鼠皮肤组织匀浆中SOD、MDA、LF的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤匀浆中SOD活性显著减弱，MDA、LF含量均显著升高（P＜0.01），说明复制模型成功。与模型组比较，白芷醇提物高、中、低剂量组小鼠皮肤匀浆中SOD活力显著增强（P＜0.01或P＜0.05），MDA含量均显著降低（P＜0.01或P＜0.05）；白芷提取液高、中剂量组小鼠皮肤匀浆中LF水平显著降低（P＜0.01）；白芷醇提物低剂量组LF水平降低效果不显著（P＞0.05）。结果提示，白芷醇提物能提高衰老小鼠皮肤组织的抗氧化能力和清除过氧化产物的能力，且在一定范围内有量效关系。白芷醇提物对衰老模型小鼠皮肤中的SOD、MDA、LF的影响见表2。

图3 白芷醇提物、维生素C对OH·的清除作用Fig 3 Scavenging effects of ethonol extract from Angelicae Dahuricae Radix and vitamin C on OH·

表2 白芷醇提物对衰老模型小鼠皮肤中SOD、MDA、LF的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix on SOD，MDA and LF in the skin of aging model mice（±s，n＝10）

表2 白芷醇提物对衰老模型小鼠皮肤中SOD、MDA、LF的影响（±s，n＝10）Tab 2 Effects of ethanol extract from Angelicae Dahuricae Radix on SOD，MDA and LF in the skin of aging model mice（±s，n＝10）

与空白对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白对照组模型组白芷醇提物高剂量组白芷醇提物中剂量组白芷醇提物低剂量组七宝美髯丸组LF/μg·g－1 0.69±0.20 1.17±0.11＊0.79±0.09##0.83±0.16##1.16±0.10 1.08±0.13#剂量/mg·10 g－1--6.0 3.0 1.5 3.0 SOD/U·mg－1 25.14±3.15 13.44±3.11＊22.06±2.19##21.91±3.45##18.86±3.53#23.69±2.64##MDA/nmol·mg－1 6.14±1.98 12.26±2.07＊7.96±1.28##8.02±1.53##9.89±1.49#8.20±1.74##

3.3 白芷醇提物对模型小鼠皮肤中Hyp、皮肤含水量的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤匀浆中Hyp、皮肤含水量均显著减少（P＜0.01或P＜0.05），说明复制模型成功。与模型组比较，白芷醇提物高、中剂量组小鼠皮肤匀浆中Hyp、皮肤含水量均显著提高（P＜0.01或P＜0.05）；白芷醇提物低剂量组小鼠皮肤匀浆含水量显著提高（P＜0.05），对提高皮肤Hyp含量效果不显著（P＞0.05）。结果提示，白芷醇提物有一定美白、抗衰老作用，并呈现一定剂量依赖关系。白芷醇提物对模型小鼠皮肤中Hyp和皮肤含水量的影响见表3。

3.4 白芷醇提物高剂量对模型小鼠皮肤中Hyp的影响与对SOD、MDA、LF等影响的多元相关分析

本研究中白芷醇提物高剂量组对衰老模型小鼠皮肤中的衰老指标Hyp和氧化或抗氧化相关指标SOD、MDA、LF等均有较显著影响，本文以皮肤Hyp为应变量，以SOD、MDA、LF等为自变量进行多元相关分析，以探讨白芷延缓皮肤衰老可能的作用机制。

多重线性回归各变量建立回归方程：Y＝－17.055+0.888X1+0.434X2+2.739X3。变量系数通过标准化转化以后，发现3个自变量对Hyp影响的大小次序依次是SOD＞MDA＞LF。多元相关分析表明，Hyp与SOD、MDA、LF组合之间的复相关系数r＝0.921，决定系数R2＝0.848，说明他们之间相关性较好。结果表明，白芷醇提物抗氧化能力与抗皮肤衰老活性间有密切关系。白芷醇提物高剂量组SOD、MDA、LF与Hyp的指标变化见表4；回归分析系数见表5；回归模型见表6。

表3 白芷醇提物对模型小鼠皮肤中Hyp和皮肤含水量的影响（±s，n＝10）Tab 3 Effects of ethomol extract from Angelicae Dahuricae Radix on Hyp and moisture in model mice skin（±s，n＝10）

表3 白芷醇提物对模型小鼠皮肤中Hyp和皮肤含水量的影响（±s，n＝10）Tab 3 Effects of ethomol extract from Angelicae Dahuricae Radix on Hyp and moisture in model mice skin（±s，n＝10）

与空白对照组比较：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.blank control group：：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白对照组模型组白芷高剂量组白芷中剂量组白芷低剂量组七宝美髯丸组水分/%59.94±3.61 49.62±2.81＊60.19±3.46##58.31±2.24##55.97±3.91#59.22±3.13##剂量/mg·10 g－1--6.0 3.0 1.5 3.0 Hyp/μg·mg－1 9.06±1.46 4.96±1.62＊＊8.15±1.32##6.48±1.74#5.71±1.56 8.08±1.65##

表4 白芷醇提物高剂量组SOD、MDA、LF与Hyp的指标变化Tab 4 Changes of SOD，MDA，LF and Hyp in ethanol extract fromAngelicae Dahuricae Radix high-dose group

表5 回归分析系数Tab 5 Regression analysis coefficient

表6 回归模型Tab 6 Regression model

4 讨论

SOD广泛存在于各种生物体内，皮肤中的SOD可有效阻止自由基对皮肤组织细胞的攻击，有除皱、除斑、美白的功效，其含量高低可以表明皮肤抗氧化能力的强弱；MDA是生物体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的细胞毒性产物之一；生物体内MDA进一步侵害细胞生成LF，LF在细胞生长衰老过程中逐渐积累，是具有光毒性的细胞内沉积物[11]，并造成细胞损伤，如沉积在动物皮肤细胞中，使皮肤粗糙、黯淡、无光泽，出现皱纹、色斑等。由此可见，上述指标（SOD、MDA、LF）是直接关切生物体内“氧化”损害与“抗氧化”的相关指标，而它们有可能是引起或延缓皮肤衰老、皮肤褐斑的关键因素[12～14]。Hyp则大量存在于皮肤的胶原蛋白和弹性蛋白中，胶原蛋白和弹性蛋白都具有一定的防老化和促再生作用，共同维持着皮肤的光滑性、柔顺性和弹性，随着皮肤衰老和老化，两者含量均有所下降，因此常用皮肤中Hyp含量来作为皮肤衰老的指标[15]。而皮肤中胶原蛋白等对氧自由基十分敏感[16]，原因在于组织中过多的H2O2、OH·、O2-等自由基会造成成纤维细胞内羟化酶失去羟化功能，则羟脯氨酸生成减少，从而破坏胶原蛋白，因此Hyp含量与体内自由基损伤及抗氧化相关指标SOD、MDA、LF等的变化有内在关联性[17]。本文中以皮肤衰老指标Hyp为应变量，以氧化或抗氧化指标SOD、MDA、LF为自变量进行多元相关分析，结果表明两种指标间有密切相关性；皮肤水分含量的测定结果，可进一步表征皮肤的老化程度，以及白芷延缓皮肤衰老的活性大小。

本研究表明，白芷醇提物在体内、外均表现出较强的抗氧化活性，体内抗氧化活性与其延缓皮肤衰老作用有相同的趋势和密切相关性，提示白芷醇提物的抗氧化作用可能为其美白和延缓皮肤衰老作用机制之一。白芷富含香豆素类、挥发油类、生物碱类、多糖类和众多微量元素等多种组分，其中很多成分都可能具有清除自由基的作用，然而究竟哪些组分怎样发挥着主要作用，以及各自贡献多少，笔者以为有必要从细胞分子水平进一步对白芷醇提物美白作用各种机制进行综合研究评价。同时由于各活性物质极性不同，不同提取部位抗氧化效果也不尽相同，也有必要对其有效成分的提取工艺做出优化和筛选，为指导白芷的临床合理应用以及相关产品的研发提供更全面详细的资料和参考。

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