泄浊除痹方总黄酮对小鼠肾小管上皮细胞增殖与尿酸吸收的影响Δ

吴新荣，臧路平，刘志刚，孙维峰（广州军区广州总医院药剂科，广州 510010）

高尿酸血症（Hyperuricemia）是指血液中的尿酸浓度高于正常水平的一种机体状态，其进一步发展会导致痛风。痛风是一种关节炎症，表现为关节处或者关节周围形成尿酸单钠结晶，促使急性炎症的发作和长期的组织损伤。痛风的长期治疗途径为降低血清和组织中的尿酸浓度。

肾小管上皮细胞（Renal tubular epithelial cells，RTECs）上固定的各种转运体负责肾脏物质的转运，其中尿酸在肾脏中的重吸收作用主要依赖于近端小管上皮细胞膜上表达的尿酸盐阴离子转运体（URAT1）[1]。

泄浊除痹方是多年来临床治疗高尿酸血症的经验方，临床试验表明，该处方对高尿酸血症有良好的治疗作用[2]。为进一步明确该处方中的主要活性成分，本课题组对其有效部位进行了分离[3]。总黄酮是在泄浊除痹方中提取出的有效部位之一，已有文献报道黄酮类化合物对尿酸吸收的影响[4]。本文在此研究基础上，探讨泄浊除痹方总黄酮体外刺激小鼠RTECs对其尿酸吸收功能的影响，为该药降尿酸机制的研究和新药的开发提供新的理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

超净工作台（江苏苏净集团有限公司）；CO2培养箱（美国Thermo Forma公司）；CKX41荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）；68酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 试药

泄浊除痹方颗粒（广州军区广州总医院药剂科，批号：101118）；DMEM/F12培养基、D-Hanks、胎牛血清（美国Hyclone公司）；人转铁蛋白、牛胰岛素、表皮生长因子、percoll细胞分离液、尿酸、尿酸检测试剂盒、MTT（美国Sigma公司）；I型胶原酶（美国Gibco公司）；青霉素（0.48 g∶80万u）、链霉素（0.96 g∶160万u））购自湖北远成药业有限公司；鼠抗人细胞角蛋白18抗体、羊抗鼠IgG（武汉博士德生物工程有限公司）；二甲亚砜（DMSO，广州化学试剂厂）；苯溴马隆（德国赫曼大药厂）。

1.3 动物

3～5周SPF级昆明种小鼠，♂，体重（18±2）g，由广州军区广州总医院动物实验中心提供（动物使用合格证号：粤检证字第2006B020号）。

2 方法

2.1 泄浊除痹方总黄酮的制备

泄浊除痹方颗粒粉碎后，60%乙醇回流提取3次，总黄酮粗提液经聚酰胺颗粒静态吸附2 h达到平衡后，先以水洗脱，继以乙醇洗脱，得到的总黄酮含量达71.84%。

2.2 小鼠RTECs的原代培养与鉴定

用优化好的方法对目的细胞进行原代培养：处死小鼠后立即无菌取肾，去除包膜及脂肪组织，取皮质部分，剪碎，消化，过筛，于37℃、5%CO2孵育箱培养。待细胞长满后用0.25%胰蛋白酶处理细胞并进行传代培养。制备细胞爬片，用细胞角蛋白18多克隆抗体（1∶250）为一抗[5]，羊抗鼠IgG为二抗，进行SP法染色鉴定。

2.3 泄浊除痹方总黄酮对RTECs增殖活性的影响

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培养液制成1×105个/mL的细胞悬液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培养箱中培养，12 h使其贴壁后弃上清液，加入不同浓度的总黄酮（0、0.5、2.5、5.0、7.5、10.0 g·L－1）DMEM培养基，培养48 h，终止培养前4 h每孔加入MTT（5 g·L－1）20 μL，培养结束后弃上清液，加入DMSO（100 μL）震荡后于酶标仪490 nm波长处测定吸光度（A），结果以5个复孔的均值表示，参考MTT法公式计算增殖率。根据试验结果选择对细胞生长影响没有统计学意义的浓度范围，进行下一步尿酸吸收试验。

2.4 泄浊除痹方总黄酮对RTECs尿酸吸收的影响

将细胞接种到96孔板，在室温下进行尿酸吸收30 min。尿酸吸收试验培养基成分为[6]：NaCl 137 mmol·L－1、KCl 5 mmol·L－1、K2HPO40.1 mmol·L－1、MgSO41.8 mmol·L－1、葡萄糖20 mmol·L－1、HEPEs 10 mmol·L－1（pH 7.4）。设定尿酸吸收取样时间点分别为0、15、30、45、60、75、90 min。吸收结束后，使用尿酸检测试剂盒检测培养基中剩余尿酸浓度，显色后，490 nm波长处检测A值。差量法计算尿酸吸收值，确定试验取样时间点。

取3～5代RTECs，用2.5%的胰蛋白酶消化后再用含10%FBS的DMEM培养液制成1×105个/mL的细胞悬液，加入96孔板，每孔100 μL，置于培养箱中培养，12 h使其贴壁后弃上清，根据MTT试验确定的尿酸吸收试验浓度，加入不同浓度的总黄酮（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1）DMEM培养基，以苯溴马隆为阳性对照。药物细胞孵育培养48 h后将培养基吸出，加入尿酸吸收培养基，于培养箱中培养30 min后，各测量孔吸取50 μL样液，根据尿酸检测试剂盒测定剩余尿酸浓度，差量法计算尿酸吸收值，并计算药物作用于尿酸吸收的抑制率，结果以5个复孔抑制率的均值表示。

2.5 统计学方法

采用SPSS统计软件处理数据，试验结果以±s表示，组间差异的比较采用单因素方差分析和t检验。

3 结果

3.1 小鼠RTECs的原代培养与鉴定

培养约3 d后在肾小管节段边缘有多边形细胞呈岛屿状长出，并逐渐增多向四周呈放射样生长，至第10天，基本长满培养瓶底。在倒置显微镜下观察细胞具有铺路石样形态特征，细胞较大，排列紧密。细胞免疫组化染色反应显示抗细胞角蛋白18染色阳性，胞质内见大量棕黄色颗粒，衬染的核呈蓝色，纯度在90%以上。小鼠RTECs原代培养10 d的情况见图1；细胞免疫组化图片见图2。

图1 小鼠RTECs原代培养10 d的情况Fig 1 The day 10 of mouse renal proximal tubule epithelial cell primary culture

图2 细胞免疫组化图片Fig 2 Cell immunohistochemistry picture

3.2 泄浊除痹方总黄酮对RTECs增殖活性的影响

高浓度泄浊除痹方总黄酮（10～5 g·L－1）能显著抑制细胞活性，影响细胞增殖（P＜0.01）；低浓度泄浊除痹方总黄酮（2.5～0.5 g·L－1）对细胞的增殖活性几乎不产生影响。因此，确定2.5～0.5 g·L－1作为尿酸吸收试验的参考浓度范围。泄浊除痹方总黄酮对RTECs增殖活性的影响见表1。

表1 泄浊除痹方总黄酮对RTECs增殖活性的影响（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

表1 泄浊除痹方总黄酮对RTECs增殖活性的影响（±s，n＝5）Tab 1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuo chubi decoction on the proliferation of RTECs（±s，n＝5）

与0 g·L－1比较：＊P＜0.01vs.0 g·L－1：＊P＜0.01

浓度/g·L－1 0 0.5 2.5 5.0 7.5 10.0增殖率/%0.421±0.006 0.423±0.005 0.420±0.001 0.100±0.011＊0.010±0.001＊0.013±0.003＊

3.3 泄浊除痹方总黄酮对RTECs尿酸吸收的影响

通过前期试验确定，尿酸吸收试验的取样时间点为30 min，即细胞进行尿酸吸收30 min后，终止吸收试验，取样测量培养基中剩余尿酸浓度。因为在该时间点，尿酸吸收速率达到最大且未达到饱和。与未加药物刺激的RTECs细胞比较，在药物刺激细胞48 h后，0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L－1各浓度对尿酸吸收均有不同程度的抑制作用，其中较高浓度抑制作用较为强烈。泄浊除痹方总黄酮对RTECs尿酸吸收的影响见图3。

4 讨论

尿酸排泄减少是造成高尿酸血症的一个主要原因，尿酸的排泄量取决于肾小管的分泌作用以及分泌后的重吸收作用。固定在肾脏近端小管上皮细胞管腔侧和基底外侧膜上的转运蛋白负责尿酸的分泌和重吸收。

本课题组的前期临床研究发现，泄浊除痹方对治疗高尿酸血症有一定的疗效，为了确定其发挥作用的活性成分，继而对该药方进行分离提取，总黄酮是所分离出的有效部位之一。本研究发现，总黄酮在没有对小鼠RTECs的增殖活性产生影响的前提下，能够明显抑制该细胞的尿酸吸收功能。提示总黄酮抑制RTECs的重吸收功能可能是泄浊除痹方治疗高尿酸血症的原因之一，而固定在该细胞上的URAT1是负责尿酸重吸收的主要蛋白，这为高尿酸血症的治疗和机制研究提供了新的理论依据。

图3 泄浊除痹方总黄酮对RTECs尿酸吸收的影响Fig1 Effects of anthoxanthin in Xiezhuochubi decoction on the uric uptake of RTECs

[1]Enomoto A，Kimura H，Chairoungdua A，et al.Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[J].Nature，2002，59（417）：447.

[2]孙维峰，张娴娴，徐 伟.泄浊除弊汤两种组方对高尿酸血症患者血尿酸水平的影响[J].华南国防医学杂志，2009，23（4）：35.

[3]吴新荣，刘志刚，颜仁梁，等.聚酰胺颗粒分离纯化土茯苓总黄酮研究[J].中药材.2009，32（10）：1 606.

[4]Yu Z，Fong WP，Cheng CHK.The dual actions of morin（3，5，7，2′，4′-pentahydroxyflavone）as a hypouricemic agent：uricosuric effect and xanthine oxidase inhibitory activity[J].J Pharmacol Exp Ther，2006，316（1）：169.

[5]毛慧娟，王笑云，徐昌芬，等.人肾近端小管上皮细胞的原代培养、传代及鉴定方法研究[J].南京医科大学学报，2004，24（6）：561.

[6]Rochelle Cunningham，Marc Brazie，Srilatha Kanumuru，et al.Sodium-hydrogen exchanger regulatory factor-1 interacts with mouse urate transporter 1 to regulate renal proximal tubule uric acid transport[J].J Am Soc Nephrol，2007，24（18）：1 419.