HPLC 法测定肺结核患者血浆中利福喷丁的浓度

刘会民，张 洁，高金泉，吴 狄（天津市海河医院，天津 300350）

利福喷丁为利福霉素类药物的衍生物，其抗结核分枝杆菌活性比利福平强2～10倍[1]，利福喷丁的最低抑菌浓度（MIC）较利福平普遍低2～4倍[2]，如使利福喷丁血药浓度保持较高水平，对于耐药的结核患者应用利福喷丁治疗仍有一定疗效[3]。目前利福喷丁临床上经常使用0.45 g，每周2次，为了解改变用药方案后利福喷丁是否能达到药物治疗浓度，笔者建立以高效液相色谱法测定利福喷丁血药浓度的方法，为临床采用合理的给药时间提供试验依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-10A高效液相色谱仪，包括LC-10A泵、SPD-10A紫外-可见检测器（日本岛津公司）；N-2000色谱工作站（浙江大学智能工程研究所）；KDC-16H型高速离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）。

1.2 试药

利福喷丁标准品（无锡山禾集团第一制药有限公司，含量：92.6%，批号：200507046）；内标：对硝基酚（天津市光复精细化工研究所，含量：100%，批号20040706）；甲醇、色谱水为色谱纯，冰乙酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-水（70∶30，用冰乙酸调节至pH＝6）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：336 nm；进样量：20 µL。

2.2 血浆样品处理

用加液器准确吸取40 μL含药血浆于带盖塑料小试管内，加入内标液200 μL，混匀，静置5 min后，于高速离心机（10 000 r·min－1）离心5 min，取上清液于450 μm滤头过滤后取20 μL进样分析。色谱图详见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+内标；C.血浆样品；1.对硝基酚；2.利福喷丁Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank plasma；B.blank plasma+internal standard；C.plasma sample；1.d-nitrophenol；2.rifapentine

2.3 标准曲线的制备

取空白血浆1 mL，加入适量利福喷丁标准品溶液，制得含药血浆，使其浓度分别为 0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、16.0、32.0 μg·mL－1。按“2.2”项下方法处理，进样测定，记录色谱峰面积，用峰面积对内标峰面积的比值（Y）作纵坐标，血浆样品的浓度（X）作横坐标进样线性回归，得利福喷丁回归方程Y＝9.54X+1.5（r＝0.999 6）。结果表明，利福喷丁血药浓度在0.25～32.0 μg·mL－1范围内线性关系良好（r＝0.999 6），最低检测限0.25 μg·mL－1。

2.4 精密度及回收率试验

将配制的利福喷丁浓度分别为0.5、4、16 μg·mL－1的标准血样，按“2.2”项下方法操作，测定其日内和日间RSD及回收率，结果见表1。

表1 精密度及回收率试验结果（n＝5）Tab 1Results of precision and recovery test（n＝5）

2.5 药物干扰试验

本文选用了临床常与利福喷丁合用的抗结核药，如异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇等药物进行观察，除利福平在内标和利福喷丁之间出峰（并不影响利福喷丁的色谱峰）外，其他药物也均未见干扰利福喷丁的色谱峰，说明本法有较强专属性。

2.6 临床应用

2.6.1 病例选取：选取26名应用利福喷丁的肺结核患者，应用剂量为450 mg，每周2次，分别在患者服药后72、96 h时抽取患者血液1 mL，与肝素混合抗凝后，4 000 r·min－1离心10 min，分离血浆，按“2.2”项下方法操作，并计算结果。

2.6.2 药物浓度监测结果：共监测患者26例，其中男性∶女性＝22∶4；年龄在21～79岁之间，平均年龄52.88岁。在72 h时，23例有药物浓度检出，浓度范围在0.07～6.83 μg·mL－1之间，96 h时的药物浓度有15例未检出，最高浓度2.55 μg·mL－1。根据药物浓度，9例患者将药物服法改为450 mg，q72h，3例患者停用利福喷丁，改用其他抗结核药治疗。

3 讨论

本文所建立的利福喷丁血药浓度的测定方法具有专属性强、快速准确等优点。处理样品采用甲醇沉淀蛋白后高速离心，取上清液直接进样，和液-液提取比较，药物损失少，简化了处理方法。文献报道[4]选用利福平为内标，但利福平易遇光分解，本文选用对硝基酚为内标，该物质结构稳定，易于获得，出峰快，与药峰分离较好。采用甲醇-水作为流动相价廉易得，对高效液相色谱仪流路部件损害小，因此，本方法具有较高的临床应用价值。

抗结核药经吸收入血后，在病灶部位需要达到一定的浓度才能起到抑制或杀灭结核杆菌的作用，药物浓度低很可能诱发耐药，浓度过高会增加药物毒副作用[5]。本文26例肺结核患者中，通过监测利福喷丁的血药浓度，其中9例缩短了给药时间，2例另改他药治疗。因此，利福喷丁在临床应用时，需要进行血药浓度监测，才能保证药物达到临床合理用药，减少耐药性的发生。

[1]陈新谦，金有豫，汤 光.新编药物学[M].第17版.北京：人民卫生出版社，2011：108.

[2]端木宏谨，刘宇红，姜广路，等.结核分枝杆菌对利福喷丁与利福平交叉耐药的实验研究[J].中华结核和呼吸杂志，2005，28（3）：192.

[3]赵黎黎，马海战，曹文利，等.利福喷丁治疗耐利福平肺结核80例临床疗效观察[J].中国防痨杂志，2006，28（4）：244.

[4]黄必义，邓立东.RP-HPLC法测定人血浆中利福喷丁的浓度[J].中国药师，2005，8（2）：129.

[5]任丽娟，王 丽，罗小祥.治疗药物监测在抗结核药物治疗中的应用[J].中国药房，2008，19（23）：1 827.