3种检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的ELISA试剂盒的比较

钱 欢，唐 利

（1.上海交通大学 农业与生物学院，上海 200240；2.杭州荐量兽用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

猪繁殖与呼吸综合征( PRRS) 是养猪业重要疾病之一。目前PRRS已经遍及全球，而且危害严重，给世界养猪业发展构成了很大威胁。据估算，因PRRS造成的流产、死胎、弱仔等，每头母猪损失约236美元，潜在损失高达502美元[1]。PRRS在我国呈现流行趋势，特别是2006年以来，因变异株PRRS引起的高致病性猪蓝耳病暴发后，我国几乎很难找到一个PRRS的阴性场，PRRS给我国养猪业造成的损失是空前的。在PRRS抗体检测方面， 国际上已经有比较成熟的试剂盒，使用比较广泛的主要是由IDEXX、INGEZIM和LSI等公司生产的PRRS抗体检测试剂盒。但是这3种试剂盒结果判定标准不一样，对临床的指导意义也存在一些差异。为了更好地使用不同试剂盒用于PRRS检测分析，我们比较了3种试剂盒的重复性、一致性以及其检测结果与临床发病之间的关系。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂盒

Kit1：IDEXX公司生产的PRRS X3抗体检测试剂盒；

Kit2：INGEZIM公司生产的PRRS UNIVERSAL（11.PRU.K.1/2）抗体检测试剂盒；

Kit3：法国LSI公司生产PRRS抗体ELISA诊断试剂盒（PRRS-Ab）。

1.1.2 血清

比较试验用的血清来自于四川某规模化猪场，共计84份，其中母猪34份，仔猪48份，初乳2份，血清免疫背景、胎次及日龄明确。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂操作

按照试剂盒说明书操作。

1.2.2 判定标准

按照其附带说明书所述方法对结果进行判定。

Kit1：阴性对照平均值NCx=1/2（NC1 A650+ NC2 A650），阳性对照平均值PCx=1/2（NC1 A650+ NC2 A650），检测样本的计算S/P=（样本A650- NCx）/（PCx- NCx），样本的S/P值低于0.4，样品应判定为PRRSV抗体阴性，样本的S/P 值大于或等于0.4，样品应判定为PRRSV抗体阳性；

Kit2：CUTT OFF值=0.15×PC A405，检测样本的计算S/P=样本A405/PC A405，样本A405小于CUTT OFF值，样品应判定为PRRSV抗体阴性，样本A405大于CUTT OFF值，样品应判定为PRRSV抗体阳性，即：样本的 S/P 值低于0.15，样品应判定为PRRSV抗体阴性，样本的S/P 值大于或等于0.15，样品应判定为PRRSV抗体阳性；

Kit3：阴性对照平均值NCx=1/2（NC1 A450+ NC2 A450），阳性对照平均值PCx=1/2（NC1 A450+ NC2 A450），检测样本的计算IRPC = [(样本A450 - NCx)/( PCx- NCx)] x 100，样本的 IRPC 值小于等于20，样品应判定为 PRRSV 抗体阴性，样本的IRPC值大于20，样品应判定为 PRRSV 抗体阳性，S/P=IRPC/100，即当样本的S/P值小于等于0.20，样品应判定为 PRRSV 抗体阴性，样本的S/P值大于0.20，样品应判定为PRRSV抗体阳性。

1.2.3 重复性试验

从84份样品中随机抽取1份，将样品设6个平行试验孔，分别使用3种试剂盒做重复性试验，操作方法严格按照操作说明书进行。

1.2.4 一致性分析

Kappa 统计量一致性强度按照文献[7]的方法进行，Kappa 值愈高表示一致性愈好，当Kappa 值<0 时，表明两方法间一致性为极差； 当Kappa 值在0.0～0.2范围内， 一致性为微弱；Kappa 值在0.21～0.40范围内，一致性为弱；Kappa 值在0.41～0.6 范围内；一致性为中度；Kappa 值在0.61～0.80 范围内；一致性为高度；Kappa 值在0.81～1.00 范围内，一致性为极强。

表1 重复性试验结果

表2 Kit1 与Kit2试剂盒一致性分析

表3 Kit1 与Kit3试剂盒一致性分析

表4 Kit2 与Kit3试剂盒一致性分析

1.2.5 病毒血症的检测

随机选取了25%的血清，抽提RNA，按照文献[1]计一对引物，检测PRRS病毒核酸。

2 结果

2.1 重复性试验

重复性试验结果从表1可以看出，同一份样品，用3种不同试剂盒检测，其阴性、阳性结果没有变化。据标准差公式计算出3种试剂盒的S/P的标准差分别为：0.085、0.019、0.039。从6个重复样品的标准差可知，3种试剂盒批内差别不显著，其中Kit2最小，试验数据具有较高的参考价值。

2.2 一致性分析

用Kappa值对3种试剂盒的检测结果两两之间进行一致性检验，Kit1与Kit2的Kappa值=0.762>0.6，表明Kit1与Kit2高度一致；Kit1与Kit3的Kappa值、Kit2与Kit3的Kappa值均为0.323>0.2，表明Kit1与Kit3、Kit2与Kit3一致性较弱 (表2、表3 和表4)。

2.3 病毒血症的检测

随机选取的21份血清中，有7份为PRRSV核酸阳性（如图1），其中PRRSV核酸阳性的血清中，3种试剂盒PRRS抗体阳性数分别为：Kit1为5份，Kit2为6份，Kit3为5份（见表5），显示PRRSV可以与其抗体同时在血清中存在，也显示3种试剂盒所检测的PRRS抗体并非中和性抗体，当然PRRSV的感染与免疫机理还有待进一步研究。

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征已经成为危害我国养猪业健康发展的重要疫病，如何有效防控成为学者关注的焦点。在实际生产过程中，我们发现适宜的蓝耳病疫苗免疫，在预防该病的暴发性发生和减轻临床症状上具有一定作用。若能够坚持长期、科学、规范的蓝耳病免疫和抗体监测，对大幅降低该病的发生几率有很大帮助。目前，高致病性猪蓝耳病活疫苗已经纳入国家强制免疫计划，农业部对活疫苗免疫合格的标准为，免疫28 d后，进行免疫效果监测，高致病性猪蓝耳病ELISA抗体IRPC值>20判为合格，存栏猪免疫抗体合格率≥70%判定为合格。但是生产实践中发现，即使达到免疫合格，临床发病的案例依然很多。

图1 PRRS核酸检测结果

表5 3种试剂盒检测结果与RT-PCR结果对比

猪只感染PRRSV野毒和接种活疫苗后，会产生一系列针对不同蛋白的抗体，但是目前没有有效的检测方法来区分野毒和疫苗毒产生的抗体。Yoon等[2]用间接免疫荧光试验(IFA)、免疫过氧化物酶细胞单层试验( IPMA)、酶联免疫吸附试验(ELISA) 和血清病毒中和试验(SVN) 对实验感染猪的体液免疫进行了监测，发现感染后7～14 d就可检出PRRSV 特异性循环抗体(IgM和IgG)，而中和抗体一般在感染后20～30 d才可检出但持续时间较长。Loemba等[3]用Western Blotting方法分析证实，PRRSV 感染猪的免疫反应主要针对E蛋白、M蛋白、N蛋白。攻毒后7 d左右在感染猪体内都能检测出抗N抗体，而抗M蛋白、E蛋白的抗体则因个体而异，首次检出时间为攻毒后9～28 d。

不同毒株间N蛋白保守性很高，因此N蛋白是ELISA包被抗原的最佳选择。本研究使用的3种试剂盒中，Kit1和Kit2为N蛋白包被，故检测的抗体为N蛋白抗体，该2种试剂盒用于感染压力评估、感染预警、诊断以及免疫评估均有良好的指导意义，但这两种试剂盒检测的抗体水平与免疫保护之间没有直接相关性。

PRRSV感染有一个很重要的特点是抗体依赖性增强作用（antibody dependent enhancement, ADE），即无论在体内或体外的试验条件下，PRRSV抗体的存在可介导和加强感染，而不是保护( K.J.Yoon 1996)。C.S.Choi 等(1992)报道,将PRRSV预先以抗PRRSV猪血清处理后再接种细胞，病毒在PAM中的感染可得以增强；而 W.T.Christianson 等(1993)发现用混有适量抗PRRSV血清的PRRSV感染子宫内胚胎，其毒价比单用病毒感染的要高。这些报道表明PRRSV能不顾体液免疫应答而持续存活，本实验也证实了这点。因此，通过血清抗体来评估PRRS疫苗的免疫效果不科学，但可以通过对PRRSV N蛋白抗体水平来监测群体中PRRSV在活跃程度。

结合临床实际情况和本实验结果，我们认为Kit1、Kit2和Kit3在PRRS抗体检测与评估方面均有各自的特点，其中Kit1和Kit2两种试剂盒重复性相对较好，用于感染压力评估和早期感染预警方面更有意义。

[1] 夏世邦，吴金华. Kappa 一致性检验在检验医学研究中的应用[J].中华检验医学杂志，2006，29：83-84.

[2] Yoon K J, Zimmerman J J, Swenson S L，et al. Characterization of the humeral immune response to porcine reproductive and respiratory syndrome(PRRS) virus infection[J]. J.Vet.Diagn.Invest,1995（7）:305-312.

[3] Loemba H D, Mounir S, Mardassi H， et al. Kinetics of humoral immune response to the major structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J] .Archive of Virology,1996,141:751-761.