HLA－DRB1 rs9269186，rs3135388 SNPs和环境因素与老年原发性高血压左室重构的关联性

蔡丽伟 孙艳伏 王桂茹 李 波 姜 晶 张 洪 陈 红 丁艳华

(吉林大学白求恩第一临床医院，吉林 长春 130021)

左室重构是原发性高血压(EH)的主要靶器官损伤，主要表现为左室肥厚(LVH)和左室扩张(LVD)。左室重构严重影响心脏的收缩及舒张功能。有研究认为除外血流动力学的影响，仍有50%的左室重量变异无法解释〔1〕，这都提示除高血压外的其他因素参与心肌重构过程。研究表明一些非血流动力学因素参与心室重构的形成，其中包括年龄、性别、遗传因素等〔2～6〕。人类白细胞抗原(HLA)基因即人类主要组织相容性复合体(MHC)是目前已知的最复杂的人类基因复合体，是群体遗传学及免疫相关疾病研究的热点〔7〕。早在1989年Dubov等〔8〕研究发现 LVH患者的 HLA－DR1和 DR4抗原含量较无LVH 的患者明显增加。随后 Emmanuel、Vlachonikolis 等〔9，10〕，研究认为HLA－DR11可能与LVH有关联，但这种关联性只表现在高血压病Ⅱ～Ⅲ级的患者，因此推测HLA与动脉血压水平有关;HLA－DQ7，DR17则与血管壁增厚有关，而且该关联性独立于血压及血脂水平。HLA分布具有明显的人种、民族、地理差别，从而导致与LVH相关的HLA基因、抗原的型别不同。本实验拟通过对汉族老年EH患者左室重构相关环境因素和遗传因素进行研究，以期确定高危人群，为人群高血压及左室重构防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 2009年5月至2009年8月来我院高干病房体检中心进行健康体检的60岁以上EH患者，经知情同意说明后，共计148例患者同意参加本研究。

1.1.2 纳入及排除标准 依据2005年中国高血压防治指南推荐标准，在未服用降压药物的情况下，2次或2次以上非同日多次血压测定所得的平均值，收缩压(SBP)≥140 mmHg或/和舒张压(DBP)≥90 mmHg，排除继发性高血压后，诊断为EH〔11〕。排除继发性高血压、甲状腺功能亢进、先天性心脏病、风湿性心脏病及心脏瓣膜病变患者;并排除瘫痪、生活不能自理的患者。

1.1.3 分组 (1)按照LVH诊断标准〔12〕，左室心肌重量指数(LVMI) ≥125 g/m2(男)，LVMI≥110 g/m2(女)，将 148 例患者分为伴有 LVH(EH－LVH+)组 51人，不伴有 LVH(EHLVH－)组92人;(2)根据超声结果，左室舒张末径(LVDd)男性≥55 mm，女性≥50 mm为 LVD，EH伴有 LVD组(EHLVD+)15人，不伴有 LVD(EH－LVD－)组133人;(3)LVMI经身高校正(LVM/h)〔9〕后分组，LVM/h≤110 为组 1，52 人;110～150为组2，64人;LVM/h＞150为组3，27人(5人未测定身高、体重、未能分组)。

1.2 研究方法

1.2.1 个人及临床信息 对EH患者常规询问病史及体格检查，获取性别(SEX)、年龄(AGE)、身高、体重、腰围(WL)、腹围(AC)、高血压家族史、病程(Course)、最高DBP及最高SBP，计算体重指数(BMI)，并采血检查空腹血糖(FPG)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)、肌酐清除率(Ccr)等。

1.2.2 LVH和LVD的测定 采用美国惠普5500型彩色多普勒心脏超声诊断仪，根据美国超声心动图(UCG)协会提出的标准，测量三个心动周期的LVDd、舒张末期室间隔厚度(IVST)、舒张末期左室后壁厚度(PWT)，分别取其平均值。以Devereux校正公式〔13〕计算左心室重量(LVM)，LVM=0.8 ×1.04〔(LVDd+IVST+PWT)3－LVDd3〕+0.6;LVMI=LVM/BSA〔14〕，体表面积(BSA)=〔0.006 × 身高(cm)+0.0128 × 体重(kg)〕－0.1529。

1.2.3 HLA－DRB1单核苷酸多态性(SNP)位点的测定 (1)DNA提取，采外周血4 ml，分装、－80℃冰箱冻存，采用Promega纯化试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)提取基因组DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。(2)引物序列见表1。(3)PCR－DNA连接酶检测反应(LDR)技术检测 SNPs:20 μl PCR 体 系:1 × Buffer，3 mmol/L Mg2+，每 个 dNTP 2 mmol/L，1 U Taq E，1 × Q－solution，0.2 pmol/L 引物混合物，50 ng DNA。PCR扩增条件:95℃变性15 min，35个循环，每个循环有 3 个温度，94℃30 s，56℃1 min，72℃1 min，最后在 72℃延伸 7 min。10 μl LDR 体 系:1 × Buffer，探 针 混 合 物12.5 pmol/L/每个，2 U Ligation E，PCR 产物 100 ng/μl。LDR条件:95℃变性2 min，30个循环，每个循环有2个温度，94℃30 s，50℃2 min。(4)上述产物应用377DNA测序电泳仪测序。

1.3 数据处理及统计学分析 运用SAS8.0统计软件，采用Epidata3.0建立数据库，各临床参数均用中位数、最大值、最小值表示，并采用非参数检验(wilcoxon秩和检验)进行组间比较。用拟合优度检验确定基因型分布是否符合Hardy－Weinberg平衡定律。SNPs基因型及等位基因频率分布采用χ2检验(Fisher′s精确概率法)，非条件多因素Logistic回归分析计算比值比和95%可信区间。

2 结果

2.1 左室重构患病率 入组EH患者148例。根据超声心动图公式法检出LVH者51例(男/女=48/3)，无LVH者92例(男/女 =87/5)。本研究中 EH患者 LVH的现患率为35.66%。LVD 15例(男/女 =14/1)，非 LVD 133例(男/女 =126/7)。EH患者伴有LVH和/或LVD者共55例，占EH患者37.16%。

2.2 HLA－DRB1 rs9269186及rs3135388 LDR图谱 rs9269186位点呈C/G二态性，群体表现为C/C、C/G和G/G三种不同的基因型。rs3135388位点呈C/T二态性，群体表现为C/C和C/T两种不同的基因型。见图1。

图1 HLA-DRB1 rs9269186、rs3135388 LDR 图谱

2.3 EH伴有LVH组与不伴有LVH组结果比较

2.3.1 EH－LVH+组与 EH－LVH－组临床特点比较 wilcoxon秩和检验结果发现，各相关因素在EH－LVH－组和EH－LVH+组之间均无统计学意义(P＞0.05)。

2.3.2 Hardy－Weinberg遗传平衡检验 对EH－LVH－组及EHLVH+组基因型频数分布分别进行拟合优度χ2检验。结果表明，两个SNP位点在各组中的基因型及等位基因频数分布均符合H－W遗传平衡定律(P＞0.05)。

2.3.3 HLA－DRB1 SNPs基因型及等位基因频数分布与LVH关联性分析 经统计分析发现，rs9269186及rs3135388位点在EH－LVH+组及EH－LVH－组间基因型及等位基因频率分布均无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表1 引物序列

2.4 EH伴有LVD组与不伴有LVD组结果比较

2.4.1 EH－LVD－组与 EH－LVD+组临床特点比较 wilcoxon秩和检验结果发现，EH－LVD+组WL及 AC均高于 EH－LVD－组，且差异有统计学意义(P＜0.05)。其余指标在两组间均无统计学差异(P＞0.05)。见表3。

2.4.2 Hardy－Weinberg遗传平衡检验 对EH－LVD－组及EHLVD+组两个SNP基因型频数分布分别进行拟合优度χ2检验得知，rs9269186及rs3135388基因型及等位基因频率均符合H－W遗传平衡定律(P＞0.05)。

表2 HLA-DRB1 SNPs基因型及等位基因频数分布与LVH关联性分析〔n(%)〕

表3 EH-LVD－组及EH-LVD+组临床特点比较〔中位数(最小值、最大值)〕

2.4.3 HLA－DRB1 SNPs基因型及等位基因频数分布与LVD关联性分析 rs9269186及 rs3135388位点在 EH－LVD+组及EH－LVD－组间基因型及等位基因频率分布均无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

2.4.4 各危险因素分层后回归分析与左室扩张的相关性 引入单因素分析中有意义的2个变量(WL及AC)进行非条件Logistic回归分析，结果表明，WL、AL与LVD相关联，P值分别是0.0244、0.0316，OR 值分别是 3.859(95%CI:2.232 ～64.157)、2.314(95%CI:1.154～11.234)。所以，WL、AC 可能是EH患者并发LVD的危险因素。

2.5 LVM/h分组分析结果

2.5.1 按LVM与身高比值(LVM/h)分组后各组临床特点比较 经 wilcoxon秩和检验结果发现，BMI及WL和AC均随LVM/h值增高而呈现增高的趋势，且在LVM/h各组之间的差异有统计学意义(P＜0.05)。其余各指标在LVM/h各组间均无统计学差异(P＞0.05)。见表5。

表4 HLA-DRB1 SNPs基因型及等位基因频数分布与LVD关联性分析〔n(%)〕

表5 按LVM/h分组后各组临床特点比较〔中位数(最小值，最大值)〕

2.5.2 Hardy－Weinberg遗传平衡检验 对组1～组3两个SNP基因型频数分布分别进行拟合优度χ2检验，得知其基因型及等位基因频率均符合H－W遗传平衡定律(P＞0.05)。

2.5.3 HLA－DRB1 SNPs基因型及等位基因频数分布与LVM/h各组间关联性分析 rs9269186及rs3135388位点在LVM/h各组间基因型及等位基因频率分布均无统计学意义(P＞0.05)。见表6。

2.5.4 各危险因素分层后回归分析与LVM/h各组的相关性引入单因素分析中有意义的3个变量(BMI、WL及AC)进行多因素非条件Logistic回归分析，结果表明:AC和BIM的OR值分别为2.936和2.417(P＜0.05)，AC和BMI是EH－LVH的危险因素。见表7。

表6 HLA-PRB1 SNPs等位基因及基因型频数分布与LVM/h关联性分析〔n(%)〕

表7 多因素非条件Logistic回归分析与LVM/h各组的相关性

3 讨论

心脏是EH最常见的靶器官损伤之一，主要表现为LVH和LVD。LVH既是高血压和心血管疾病的靶器官损伤，又是心血管事件和全病因死亡的独立危险因素及预测因子〔15〕。研究发现，轻度高血压患者中，LVH者占20%;严重高血压患者中，LVH者占50%〔16〕，148例研究对象中左室重构以LVH为主，该研究人群LVH的现患率高达35.66%。而LVH和/或LVD者共55人，占EH患者37.16%。尽管LVH的发病机制还没有完全弄清楚，但是研究认为一些血流动力学和非血流动力学因素与 LVH 相关〔17〕。

流行病学调查认为年龄是LVH发展的一个非常重要的危险因素〔18〕。研究认为年龄是LVH的独立危险因素〔19〕，单因素分析未发现年龄与LVM定义的LVH的关联;但进一步以LVM/h为观察指标，发现随着年龄的增高，LVM/h比值亦呈增高趋势，但差异无统计学意义。有研究认为年龄增加对LVH的影响是通过成纤维细胞生长因子的表达来实现的〔20〕。Phyllis〔21〕等通过对7～18岁青少年EH患者的左室几何构型的研究发现，SBP和BMI是LVH的影响因素，但是离心性LVH患者伴有更高的DBP。由此考虑不同年龄段的EH患者LVH的影响因素可能不同，老年人EH靶器官损伤的影响因素有待进一步研究。

除年龄因素外，许多其他环境因素对LVH的影响也引起了注意。Rodrigues等对682例患者进行4种肥胖指数测定，其中包括BMI、WL、AC和WL/h。研究发现WL/h是除腰臀比外，其他三项测定指标中最显著的预测因子，且不受性别的影响。认为由WL/h测定的腹型肥胖，而不是全身肥胖，是女性LVH较好的预测因子〔22〕。另外研究〔23〕认为高血压病程是EH伴LVH的危险因素，发现EH－LVH+组患者的BMI、WL/AC及EH病程均较EH－LVH－组高，但是无统计学差异。故根据Emmanuel等的研究方法〔9〕，将LVM用身高校正，即LVM/h，根据LVM/h值分组后进行单因素分析，结果发现BMI、WL及AC与LVM/h相关(P＜0.05)，进一步将上述单因素分析中有意义的变量进行多因素非条件Logistic回归分析，发现BMI及 AC的 OR值均＞1，95%可信区间不包括1，所以认为BMI、WL及AC可能均是LVH的危险因素。研究表明性别、糖尿病、代谢综合征、陈旧性心肌梗死(MI)、主动脉硬化和心脏瓣膜反流性疾病均和LVH 相关〔24～28〕，而未发现性别、FPG、TG、TC、HDL－C、LDL－C 在EH－LVH－组和 EH－LVH+组之间或 LVM/h分组之间的差异。Hyper〔29〕研究认为代谢危险因素(肥胖、糖尿病和高胆固醇血症)一起作用时伴有更明显的LVH及更高的LVH发病率。本研究未发现上述指标在两组之间的差异有统计学意义。Sharma等〔30〕认为碳水化合物和高脂饮食能够影响心脏生长代谢及心脏功能，碳水化合物和高脂饮食对LVH的病理过程有潜在的影响。Drazner等〔31〕研究认为高盐饮食(独立于高血压的影响)者和工作压力大的人均具有较高的LVH发病率。

无论在人类还是在动物模型的研究均发现，高血压本身只能解释部分心脏指数改变的原因，其余高达60%的原因归咎于基因因素。HLA所在6号染色体区域是基因丰富、高选择性区域。该区域的连锁平衡不稳定模式及等位基因频率在不同地理人群中可以很好地鉴定，所以成为群体遗传学疾病研究的热点。早在1989年Dubov等就已经开始研究HLA与LVH之间的相关性，并发现LVH患者的HLA－DR1和DR4抗原含量较无LVH的患者明显增加〔15〕。2001年Emmanuel等对158例新发EH的雅典人研究HLA抗原是否是心血管重构的危险因素之一。他们通过超声测定LVM、颈动脉内膜中层厚度(IMT)，其中LVM用身高校正，即LVM/h，并应用PCR技术测定HLA基因的表型。结果发现携带HLA－Ⅱ类抗原特异性DQ7、DR11的EH患者LVM/h高于非携带者;而携带HLA－B51的EH患者LVM/h低于非携带者;从而认为HLA－DQ7、DR11可能是LVH的易感基因，而HLA－B51可能是抵抗基因，具有一定的保护作用，推测某种HLA表型可能与EH－LVH有关联〔16〕。随后 Vlachonikolis等对雅典同种族的希腊人进行相关研究，应用方法与Emmanuel等方法相似。结果发现携带HLA－DR11的EH 2级或3级组LVM/h高于非携带者。这就再次证明HLA－DR1l可能是LVH的易感基因。但是这种关联性在血压正常组及轻度高血压组之间并未发现。推测HLA与动脉血压水平有关。即只有暴露于较高的血压水平时HLA才可以作为心血管重构的促进因子。

基于上述研究，本研究假定HLA－DRB1与EH左室重构相关。选定HLA－DRB1的2个SNPs位点(rs9269186、rs3135388)，通过多重PCR－LDR技术测定，扩增出包含SNPs位点的基因片段，再通过DNA电泳测定相应位点碱基多态性，最后统计分析该位点是否与左室重构相关，从而验证假设。但是研究结果未发现上述两个多态位点与左室重构相关联，一方面可能由于样本数量小，没有足够的检验效能，检出有意义的差异;另一方面由于在不同人群、地区、种族存在遗传异质性，也可降低检测疾病与某一特异SNPs之间关联研究的统计效力。因此，应进一步扩大样本数量，在不同的人群中对HLA－DRB1基因的其他SNPs位点与EH左室重构的关系进行研究。

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