叶酸、维生素B12对高同型半胱氨酸血症大鼠ICAM-1及VCAM-1表达的影响

王 新 郭晓林 王玉玲 姜雅秋 (吉林大学第一医院心血管中心，吉林 长春 300)

目前国内外大量研究表明，高同型半胱氨酸(Hhcy)是动脉粥样硬化(AS)的一个独立危险因子〔1，2〕，血管壁免疫炎症反应可能是Hhcy致AS的机制之一〔3〕。细胞黏附分子(cell adhesion molecules，CAM)是位于细胞膜表面的大分子跨膜糖蛋白，在炎症反应过程中起重要的作用〔3〕。叶酸、维生素B12是Hhcy代谢的辅助因子，可降低体内同型半胱氨酸(Hcy)的水平;但是通过补充叶酸和维生素B12是否能防止AS的进展，目前国内尚未报道。本研究通过观察叶酸、维生素B12对Hhcy大鼠主动脉壁细胞间黏附分子(ICAM-1)及血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响，进一步探讨Hhcy导致AS的机制及叶酸、维生素B12对AS的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 8周龄雄性SD大鼠，体重190～210 g，由沈阳医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号:SCXK(辽)2003-0016。饲料为繁育鼠全价固体颗粒饲料，沈阳市于洪区前民动物饲料厂提供。蛋氨酸(Sigma公司，C7352)。叶酸(片剂)，天津飞鹰制药有限公司生产(20060408)。维生素B12(片剂)，山西云鹏制药有限公司生产(20061107)。ICAM-1、VCAM-1、免疫组织化学染色用一抗、二抗，购于北京中山生物技术工程公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及标本采集 将24只雄性SD大鼠随机分为三组，每组8只。空白对照组:喂食基础饲料，每日灌胃给予生理盐水5 ml/kg。HHcy模型组:喂食高蛋氨酸饲料(基础饲料中加入1.7%蛋氨酸)+每日灌胃给予生理盐水5 ml/kg。叶酸、B12干预组:喂食高蛋氨酸饲料 +每日灌胃给予叶酸3.5 mg/kg、维生素B127 μg/kg。干预药物每日用量为成人常用量等效剂量的4～6倍。各组SD大鼠连续灌胃给药8 w，分笼饲养，自由进食饮水，于8 w处死所有大鼠，取血10 ml、升主动脉近心段0.5 cm。

1.2.2 主动脉壁形态学观察 将所取主动脉10%中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，苏木素-伊红(HE)染色，将切片置于光镜下观察其形态学变化并拍照。

1.2.3 应用ELISA法检测血浆Hcy水平。

1.2.4 应用链亲素卵白素-过氧化物酶(SP)法检测主动脉壁ICAM-1和VCAM-1的表达 取组织切片脱蜡水化，0.3%H2O2甲醇处理切片20 min，蒸馏水、磷酸盐缓冲液(PBS)各洗5 min。用枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复15 min，取出迅速冷却，PBS洗3次，1 min/次。滴加封闭液，37℃孵育20 min，倾去不洗。分别加入用PBS按1∶100稀释的ICAM-1和VCAM-1一抗37℃孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。加入二抗，37℃孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min。加入SP复合物孵育20～30 min。PBS洗3次，每次2 min。二氨基联苯胺(DAB)-H2O237℃孵育10 min。PBS洗，蒸馏水洗。Harris苏木素染核10 min。蒸馏水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。光镜下观察，每片随机选取3个视野进行阳性细胞百分数计数。设立阴性对照(以PBS代替一抗)。

1.3 统计学方法 应用SPSS15.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用成组单因素方差分析。

2 结果

2.1 主动脉壁形态学观察 空白对照组血管壁结构清晰，内膜光滑完整，平滑肌细胞排列整齐，内皮细胞结构完整，内皮下未见脂质及炎性细胞浸润，中层及外膜结构清楚，未见病理改变;Hhcy模型组可见血管壁弥漫性隆起，突向管腔面，形成明显斑块，内膜明显增厚，内膜下大量排列不规则平滑肌细胞(SMC)增生，内有脂质沉积，形成大小不等、形态不规则的泡沫细胞，胶原纤维和弹性纤维增多，内膜中有大量巨噬细胞浸润，中层结构紊乱，平滑肌增生、坏死，并有炎性细胞浸润，弹力板处及细胞间隙可见大量脂质沉积;叶酸、维生素B12干预组与HHcy模型组比较，胸主动脉血管壁无明显隆起，内膜下有少许炎性细胞浸润，中层平滑肌无明显增生，未见泡沫细胞。见图1。

2.2 各组血浆Hcy水平比较 各组血浆Hcy水平具有差异，Hhcy模型组的血浆Hcy水平明显高于空白对照组(P＜0.01)。Hhcy模型组血浆Hcy水平明显高于叶酸、维生素B12干预组(P＜0.01)。见表1。

图1 三组主动脉壁形态学观察(HE，×100)

2.3 各组血管壁ICAM-1、VCAM-1表达 各组血管壁ICAM-1、VCAM-1表达水平具有差异，Hhcy模型组的血管壁 ICAM-1、VCAM-1表达明显高于空白对照组(P＜0.01)。Hhcy模型组血管壁ICAM-1、VCAM-1表达明显高于叶酸、维生素B12干预组(P＜0.01)，但是仍高于空白对照组(P＜0.05)。见表1。

表1 血浆 Hcy、血管壁ICAM-1、VCAM-1在各组中的表达水平( ± s，n=8)

表1 血浆 Hcy、血管壁ICAM-1、VCAM-1在各组中的表达水平( ± s，n=8)

与空白对照组比较:1)P＜0.01;与Hhcy模型组比较:2)P＜0.01

组别 血浆Hcy(μmol/L)主动脉壁ICAM-1(%) VCAM-1(%)7.39±2.46 15.04±4.59 18.75±3.17 Hhcy模型组 115.04±10.971) 52.51 ±7.941) 55.86±11.561)叶酸、B12组 16.13±1.152) 23.35±4.692) 28.55±3.632)空白对照组

3 讨论

ICAM-1和VCAM-1是近年研究较多的细胞膜表面大分子跨膜糖蛋白，是细胞之间及细胞与细胞外基质之间的一类黏附物质的总和，属于免疫蛋白超家族的一员，可促进血液中游走的单核细胞向内皮细胞黏附，进入炎症部位，导致AS形成〔4〕。Neville等发现长期接触Hcy的上皮细胞ICAM-1、组织型纤溶酶原激活物抑制物-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)的表达水平升高，且ICAM-1，PAI-1表达水平与内皮衰老程度呈正相关〔5〕。Koga等〔6〕同时发现人动脉内皮细胞在Hcy刺激下可增加表面黏附分子VCAM-1和E-选择素的表达和mRNA水平。本研究表明，Hhcy模型组ICAM-1和VCAM-1表达水平较空白对照组明显上调，进一步表明ICAM-1和VCAM-1参与了Hhcy所致AS形成过程。

Hcy又称高半胱氨酸，是一种含硫氨基酸，为蛋氨酸脱甲基后的产物。维生素B12是Hcy代谢的辅酶，可使5-甲基四氢叶酸转变为四氢叶酸，所供出的甲基由Hcy获得在蛋氨酸合成酶作用下形成蛋氨酸。如维生素B12降低可使Hcy形成蛋氨酸受阻，造成Hcy水平升高。叶酸缺乏时，可导致Hcy再次甲基化生成蛋氨酸受阻，同时还影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性，进一步影响甲基四氢叶酸的生成，是影响Hcy水平的最主要因素〔7〕。黄延焱等〔8〕研究发现血清叶酸、维生素 B12浓度与血清Hcy水平呈负相关，增加叶酸、B族维生素的摄入可降低Hcy水平。本组观察表明，叶酸、维生素B12干预组Hcy水平明显低于Hhcy模型组，与国内外研究相符。同时根据光镜下动脉壁形态学观察可发现叶酸、B12干预组与Hhcy模型组比较主动脉血管壁无明显隆起，内膜下有少许炎性细胞浸润，中层平滑肌无明显增生，未见泡沫细胞。说明补充叶酸和维生素B12可减轻Hhcy动脉粥样硬化程度，对Hhcy致AS具有明显预防作用。

1 Sadeghian S，Fallahi F，Salarifar M，et al.Homocysteine，vitamin B12and folate levels in premature coronary artery disease〔 J〕.BMC Cardiovasc Disord，2006;6:38.

2 Kaul S，Zadeh AA，Shah PK.Homocysteine hypothesis for atherothrombotic cardiovascular disease:not validated〔J〕.J Am Coll Cardiol，2006;48(5):914-23.

3 张星虎.炎性反应与动脉粥样硬化〔J〕.中国卒中杂志，2008;3(6):408-12.

4 Galkina E，Ley K.Vascular adhesion molecules in atherosclerosis〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007;27(11):2292-301.

5 Xu D，Neville R，Finkel T.Homocysteine accelerates endothelial cell senescence〔J〕.FEBS Lett，2000;470(1):20-4.

6 Koga T，Claycombe K，Meydani M.Homocysteine increases monocyte and T-cell adhesion to human aortic endothelial cells〔J〕.Atherosclerosis，2002;161(2):365-74.

7 Skurk C，Walsh K.Death receptor induced apoptosis:a new mechanism of homocysteine-mediated endothelial cell cytotoxicity〔J〕.Hypertension，2004;43(6):1168-70.

8 黄延焱，卢晓哲，程梅芬.老年脑梗死患者血清同型半胱氨酸水平及药物干预研究〔J〕.中国临床康复，2003;7:1112-3.