衰老因素对动脉粥样硬化大鼠血脂等指标的影响

迟惠英 陈 川 郁志华 陈久林 申定珠 邢三丽 赵红彬

(上海市中医老年医学研究所，上海 200031)

动脉粥样硬化(AS)性疾病形成机制，有脂质浸润、炎症、血栓形成、单克隆、氧化应激等多种学说〔1〕，目前认为上述几种学说均无法完全解释其形成机制。近年来发现，AS患者端粒缩短及端粒酶活性降低，这即明确其在本质上是增龄性的退行性病变。AS的模型多是基于高脂饮食，很少将衰老因素纳入其中，这便与实际存在一定的脱节。在临床上即可见一些有着颈动脉斑块但是血脂正常的老年人。为此，本研究以大鼠为实验动物，将高脂饲料合并腹腔注射维生素D3建立的经典AS模型，与皮下注射D-半乳糖建立的亚急性衰老模型相结合，建立AS与衰老符合模型，并通过检测相关指标，探讨衰老在动脉硬化形成过程中所起的作用，及其对血脂等指标的影响，亦以有助于AS模型设计的优化。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2月龄健康雄性SD大鼠，体重(200±20)g，购自上海中医药大学实验动物部。

1.2 试剂与仪器 注射用维生素D3(上海通用药业股份有限公司)，D-半乳糖粉剂(BIO BASIC INC)，总胆固醇(TC)试剂盒、甘油三酯(TG)试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、氧化型LDL(ox-LDL)试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司)，丙二醛(MDA)测试试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成公司)。Power Wave XS微孔板分光光度计(BioTek)。

1.3 模型建立 在清洁级实验环境下给予普通饲料适应性喂养1 w后，将SD大鼠采用随机数字表法随机分为4组，分别为正常组，模型组(AS组)，衰老组，AS+衰老组。正常组及衰老组给予普通饲料，AS组及AS+衰老组给予高脂饲料(高脂饲料配方:3%胆固醇、0.5%胆酸钠、0.12%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%猪油、81.38%基础饲料)，各组自由饮食。参照文献〔2〕所用维生素D3总剂量，按用药时间及大鼠体重变化进行计算，并将传统腹腔注射的方法改为灌胃以减小药物的刺激作用，AS组每周以150 U/g维生素D3灌胃。D半乳糖组造模方法参照文献〔3〕，每天以100 mg/kg D-半乳糖皮下注射。AS+衰老组灌胃维生素D3同时皮下注射D-半乳糖。灌胃量为1 ml，皮下注射量为0.2 ml。

1.4 检测指标及方法 14 w后，将大鼠麻醉，腹主动脉取血，每只取5 ml注入非抗凝玻璃管中，室温静置2 h，3000 r/min离心15 min，取上清分装在2 ml EP管中，－80℃保存备用。检测时将血清和试剂盒从冰箱中取出，平衡至室温。按说明书要求配成各种工作液，以空白管调零，按说明书要求，测定相应波长的吸光度值。

1.5 统计学方法 采用SPSS15.0统计软件包进行统计分析。计量资料采用±s表示，方差齐时多组计量资料采用单因素方差分析;若方差不齐则采用非参数检验。

2 结果

2.1 各实验组脂代谢相关指标水平的测定 见表1。与正常组比较，各实验组TC、LDL-C水平明显上升(P＜0.05)。AS+衰老组HDL-C含量与正常组有差别(P＜0.05)。动脉硬化指数(AI)各实验组与正常组均有差异(P＜0.05)。对AS+衰老组与AS组和衰老组分别进行比较，以上四项指标均有明显差异(P＜0.05)。与正常组比较，AS组、AS+衰老组TG水平升高(P＜0.05)。ox-LDL水平AS+衰老组与正常组有差别(P＜0.05)。AS+衰老组与AS组和衰老组分别进行比较，在ox-LDL和TG含量方面均可见升高趋势，部分有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 各实验组SOD及MDA水平比较 见表2。与正常组比较，其他实验组血清MDA水平有升高趋势，AS+衰老组有统计学意义，血清SOD水平均降低(P＜0.05)。证明无论是AS、衰老还是衰老伴随AS都可以导致血清SOD水平的降低。

表1 各实验组血脂水平比较( ± s，mmol/L)

表1 各实验组血脂水平比较( ± s，mmol/L)

与正常组比较:1)P＜0.05;与AS组比较:2)P＜0.05;与衰老组比较:3)P＜0.05

56±1.32 1.06±0.28 AS组 9 1.78±1.451) 0.60±0.15 4.88±1.151) 2.97±2.321) 4.43±1.62 2.80±2.021)3)AS+衰老组 7 3.37±1.581)2)3) 0.35±0.161)2)3) 6.29±1.221)2)3) 11.71±6.571)2)3) 8.77±1.811)2) 2.16±1.221)3)衰老组 7 1.53±0.831)3) 0.59±0.14 2.44±0.931)2) 2.49±1.341) 4.26±2.08 1.10±0.282)LDL-C HDL-C TC AI ox-LDL TG正常组 8 0.36±0.24 0.76±0.26 1.14±0.32 0.46±0.30 3.组别 n

表2 各实验组血清MDA及SOD水平比较(±s)

表2 各实验组血清MDA及SOD水平比较(±s)

与正常组比较:1)P＜0.05;与衰老组比较:2)P＜0.05

组别 n MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)8 10.58±2.96 155.78±2.82 AS组 9 11.54±1.54 147.45±3.021)AS+衰老组 7 12.82±1.221)2) 149.58±3.991)衰老组 7 10.44±1.46 146.78±7.091)正常组

3 讨论

文献报道的可以引起AS的危险因素距今为止已有300多个，高脂血症、高血压、吸烟、糖尿病等是最早被公认的重要的危险因素。有文献报道称，LDL、血清TC水平升高与AS发病率呈正相关〔4〕。经氧化修饰的ox-LDL能够刺激巨噬细胞转变为泡沫细胞，促进白细胞和血小板的黏附、聚集，平滑肌细胞增生，从而促进血栓形成，促进AS的发生和发展〔5〕。经氧化应激后产生的ROS可以将LDL氧化生成ox-LDL，并进一步通过造成内皮细胞损伤、导致内皮功能障碍，促进巨噬细胞和平滑肌细胞增殖来促进AS的发展演化。氧化应激后生成的ROS可以调节转录活化因子AP-1和核因子NF-κB信号的表达，促进炎症有关的基因产物的产生。与LDL相反，HDL具有抗动脉粥样硬化的作用〔6〕。它可以抵抗LDL的氧化修饰作用，参与胆固醇的逆向转运，减少脂质在血管壁的沉积。HDL还能保护内皮屏障功能，降低细胞黏附分子的表达，具有保护动脉血管的作用〔7〕。本实验中，各模型组大鼠血清 TC、TG、LDL、AI、ox-LDL含量都有所升高，HDL水平降低，以AS+衰老组变化最为明显，证明经老化因素干预后，复合模型大鼠血脂较单纯AS模型变化明显。

AS时可以导致血清中SOD降低〔8〕。MDA是一种脂质过氧化物，其水平高低可以反映机体内脂质过氧化程度，从而间接反映出细胞损伤的程度〔9〕。MDA通常与SOD相配合以反映机体细胞受自由基攻击的严重程度和机体清除氧自由基的能力。本实验结果表明AS后血清中SOD降低而MDA相应的增高，证实AS后机体对氧自由基的清除能力减弱，而脂质过氧化程度加重。而AS+衰老组该项指标变化较另外两造模组明显，也证实了增龄在AS的形成过程中起到了一定作用。

流行病学调查表明，端粒长度的缩短与冠心病、脑卒中等AS性疾病的发生率随年龄的增加而上升，而这与端粒、端粒酶随增龄的变化趋势也是一致的〔10〕。Benetos等〔11〕选取了163例高血压男性用B超检查是否存在颈动脉粥样斑块，同时测量起白细胞端粒长度。将结果进行对比发现，高血压伴有颈动脉粥样斑块的患者，其白细胞端粒长度较无颈动脉粥样斑块的高血压患者明显缩短，说明白细胞端粒长度的缩短与颈动脉粥样硬化的易患性有关。我所林水淼教授总结多年临床经验，在国内首次提出增龄导致动脉粥样硬化的理论，并通过对模型动物用药显效证实了其理论的正确性〔12，13〕。

皮下注射D-半乳糖造成亚急性衰老模型与高脂饲料加维生素D3致AS模型组合，并与进行单项干预的实验组进行比较，可见该复合模型较单因素造模在各项指标上有更加明显的变化，证实年龄是影响AS的一个重要因素。

1 杨永宗.动脉粥样硬化性心血管病基础与临床〔M〕.北京:科学出版社，2009:53-67.

2 杨鹏远，芮耀诚，焦亚斌.动脉粥样硬化大鼠实验模型的建立〔J〕.第二军医大学学报，2003;24(7):802-4.

3 徐 智，吴国明.大鼠衰老模型的初步建立〔J〕.第三军医大学学报，2003;2(4):312-5.

4 Skalen K，Gustafsson M，Rydberg EK，et al.Subendothelial retention of atherogenic lipoproteins in early atherosclerosis〔J〕.Nature，2002;417(6890):750-4.

5 Lusis AJ.Atherosclenosis〔J〕.Nature，2000;407(6801):233.

6 Despres JP，Lemieux L，Dagenais GR，et.HDL-cholesterol as a marker of coronary heart disease risk:the Quebec cardiovascular study〔J〕.Atheroselerosis，2000;153(2):263-72.

7 von Eckardstein A，Hersberger M，Rohrer L.Current understanding of the metabolism and biological actions of HDL〔J〕.Curr Opin Clin Nutr Metab Care，2005;8(2):147-52.

8 林庆斌，廖升荣.SOD的研究进展〔J〕.化学世界，2006;5:378.

9 樊晓寒，惠汝太.高尿酸血症与心血管疾病〔J〕.临床心血管病杂志，2007;23(5):323.

10 Lakatta EG，Levy D.Arterial and cardiac aging:major shareholders in cardiovascular disease enterprises.PartⅠ:Aging arteries:a“set up”for vascular disease〔J〕.Circulation，2003;107(1):139-46.

11 Beneyos A，Gardner JP，Zureik M，et al.Short telomeres are associated with increased carotid atherosclerosis in hypertensive subjects〔J〕.Hypertension，2004;43(2):182-5.

12 徐品初，林水淼.补肾益气方及其拆方对氧化低密度脂蛋白损伤血管内皮细胞的影响〔J〕.现代中西医结合杂志，2004;13(16):2129-30.

13 徐品初，林水淼.补肾益气方及其拆方对ox-LDL所致“AS”症血管平滑肌细胞病理模型的影响〔J〕.中药药理与临床，2010;26(2):62-4.