仙灵骨葆对去势大鼠骨量和生物力学性能的影响

邢 磊 焦颖华 耿丽华 孙 尧 (河北联合大学附属医院老年病科，河北 唐山 063000)

骨质疏松(OP)作为中老年人群多发疾病之一，严重威胁老龄人口健康的同时也带来了沉重的社会和经济负担〔1〕。目前对于OP的临床治疗一线药物多为骨吸收抑制剂〔2〕，随着祖国医学的不断发展，包括仙灵骨葆在内的多种中药制剂在临床和基础研究中均表现出一定的促进骨形成的作用〔3〕，但具体作用机制尚有待进一步研究，本研究旨在通过血清学、骨组织形态计量学、生物力学等检测指标，探讨仙灵骨葆对去卵巢OP大鼠模型的治疗作用及其作用机制，为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 仙灵骨葆(贵州同仁堂)，ELISA免疫试剂盒(上海史瑞可生物科技有限公司)。3月龄SD雌性大鼠24只，北京维通利华实验动物养殖中心提供，动物合格证号SCXK(京)2002-0003号，平均体重(275±15)g。动物于清洁级动物室饲养，自由进食消毒颗粒，饮消毒水，单笼饲养。室温(22±1)℃，湿度(67±5)%，定期紫外线消毒。

1.2 动物分组及处理 所有大鼠随机分为3组，每组8只:正常对照组(N)、去卵巢骨质疏松模型组(OVX)、仙灵骨葆药物治疗组(XLGB)。OVX的制备:采用 1%戊巴比妥钠以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射麻醉，背侧入路，以后方髂骨嵴上2 cm、脊柱旁1 cm处取纵行切口，长约1 cm，暴露腹腔卵巢并予以切除后，以丝线将残端结扎，逐层关闭伤口。

将仙灵骨葆用双蒸水溶解成悬浊液，以灌胃针灌胃(250 mg·kg－1·d－1)，OVX 组给予等量双蒸水灌胃，持续8 w，留取血、尿(24 h)后处死所有大鼠，取其左侧完整的股骨、胫骨备行骨密度及骨组织形态计量学测量。

1.3 血、尿骨代谢指标的检测 所有大鼠处死前留取24 h尿液，再分别抽取外周血2 ml，采用ELISA法检测血Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)值、尿脱氧吡啶诺啉排泄率(DPYD/Cr)和尿Ⅰ型胶原氨基末端肽排泄率(NTX/Cr)值。

1.4 骨密度(BMD)检测 应用Norland-XR36双能X线骨密度测量仪(DEXA，美国)，测量大鼠左侧股骨BMD。依据骨密度测量仪实际扫描测量的股骨长度，均分为4等分，上1/4为近端(pBMD)，中1/2为中段(mBMD)，下1/4为远端(dBMD)。

1.5 骨组织形态计量学骨标本制作和测量方法 骨组织不脱钙制片，取大鼠右侧股骨下端，经固定、脱水、甲基丙烯酸甲酯包埋、不脱钙切片后，行Von Kossa及Giemsa染色。用 Leica DMLB2荧光/光学显微镜及Leica DC300数码摄像系统进行观察与摄取图像。

骨计量学测量指标及方法:骨组织形态计量学的动态和静态参数在股骨远端干骺端生长板下1～4 mm范围内的次级松质骨中测量，分内、中、外三点随机选取图像录入微机，每个标本采用两种观察方法，每种9个图像(组织学观察用Giemsa染色、普通光源;类骨质观察用von Kossa染色)，然后采用Leica QWin多功能彩色病理图像分析软件进行骨组织形态计量学参数测定。

1.6 三点弯曲实验 取所有大鼠的右侧股骨行三点弯曲试验，支点跨距(L)为20 mm，中央垂直(股骨与载荷成90°角)施加载荷，速率10 mm/min，在软件里直接得到最大载荷(FM)。

1.7 统计学分析 实验数据建立EXCEL数据库，资料用t检验来处理。实验数据以±s表示。

2 结果

2.1 ELISA检测结果 OVX组血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr值显著高于N组，XLGB能显著降低血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr值，但仍显著高于N组(均P＜0.05)。见表1。

表1 血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr水平( ± s，n=8)

表1 血PINP、尿DPYD/Cr、尿NTX/Cr水平( ± s，n=8)

与N组比较:1)P＜0.05;与OVX组比较:2)P＜0.05，下表同

组别PINP(μg/ml)DPYD/Cr(nmol/mmol)NTX/Cr(nmol/mmol)0.148±0.031 1.620±0.514 5.211±0.912 OVX组 0.339±0.0621) 3.865±0.7211) 8.974±1.1281)XLGB组 0.241±0.0451)2)2.609±0.5971)2)6.743±1.1851)2)N组

2.2 BMD检测结果 OVX组大鼠股骨全长，近端、远端BMD均显著低于N组，XLGB组近端和远端BMD显著高于OVX组。见表2。

表2 BMD检测结果(g/mm3， ± s，n=8)

表2 BMD检测结果(g/mm3， ± s，n=8)

组别0.010 OVX组 0.189±0.0121)0.188±0.0101)0.185±0.0181)0.198±0.0121)XLGB组 0.203±0.0141)0.206±0.0131)2)0.198±0.0161)0.217±0.0091)2)tBMD pBMD mBMD dBMD N组 0.238±0.011 0.229±0.017 0.249±0.015 0.243±

2.3 骨组织形态计量学检测结果 N组骨小梁相对体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)显著高于OVX、XLGB组，骨小梁分离度(Th.Sp)及骨吸收周长百分数(Er.Pm)、破骨细胞数(Oc.No/Tb.Ar)、类骨质周长百分数(O.Pm)显著低于OVX、XLGB组。XLGB组BV/TV、骨小梁厚度Tb.Th、荧光标记周长比L.Pm(%)、骨形成率(BFR/BV)显著高于OVX组，Th.Sp、Er.Pm、Oc.No/Tb.Ar显著低于OVX组。见表3。

表3 骨组织形态计量学检测结果( ± s，n=8)

表3 骨组织形态计量学检测结果( ± s，n=8)

指标 N组 OVX组 XLGB组BV/TV(%) 30.85±4.78 15.22±5.011) 24.20±4.661)2)Tb.Th(μm) 87.64±10.66 58.96±8.951) 73.39±7.821)2)Tb，N(#/mm) 2.15±0.40 1.88±0.19 2.05±0.44 Tb，Sp(μm) 425.11±98.79 883.52±149.891)691±138.561)2)%L.Pm(%) 9.46±2.02 11.66±2.18 14.81±1.861)2)BFR/BV(%/年)41.17±8.26 50.60±10.77 66.77±12.301)2)Er.Pm(%) 10.04±2.12 22.28±5.011) 15.48±3.391)2)O.Pm(%) 14.22±4.48 20.41±5.081) 24.19±6.681)Oc.N(#/mm2) 0.07±0.04 0.34±0.111) 0.16±0.071)2)

2.4 生物力学检测结果 三点弯曲检测股骨最大载荷结果:N组 108.64±14.58，OVX组 111.75±16.82，XLGB组106.91±11.40，各组间比较差别无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

骨转换水平增高是绝经后OP的骨代谢特点。Ⅰ型胶原衍生自Ⅰ型前胶原，是矿化骨中惟一的胶原类型，其含量占骨有机基质的90%，PINP即Ⅰ型前胶原氨基端前肽，是成骨细胞合成并释放出Ⅰ型前胶原的细胞外分解产物，PINP在血液中的含量主要反映骨转换的情况和Ⅰ型胶原的合成速率，升高提示骨转换活跃，Ⅰ型胶原合成速率加快。目前认为PINP是新骨形成的特异性的敏感指标〔4〕，而且稳定性较高，所以PINP是诊断OP的敏感生化指标〔5〕。DPYD是近年来推出的反映骨吸收的一个生化指标，主要来自骨骼，仅存于骨的Ⅰ型胶原中〔6〕，可显示全身骨质流失的情况。在临床检验中，为去除尿液浓缩稀释对尿DPYD的影响，通常用尿DPYD/Cr表示。NTX是Ⅰ型胶原降解产生的交联物的一部分，骨吸收时释放入血，部分出现于尿液中，是特异的反映骨吸收状态的指标。在对OP的诊断及其并发症预测等方面均有参考价值〔7〕。

本研究中去卵巢组上述骨代谢指标均显著升高，呈高骨转换模型，与临床女性绝经后骨质疏松的表现相似。而仙灵骨葆可降低其骨转换水平，使骨代谢维持在更稳定的水平。

目前OP的临床治疗尚无理想药物，临床应用最为广泛的骨吸收抑制剂亦有其局限和不足〔8〕。虽然以基因治疗为代表的以促进骨形成为靶向的新的治疗方法已逐渐成为研究热点，但多因“非单一骨靶向作用”限制了其临床应用〔9〕。因此，目前对OP的药物治疗仍有待完善，以仙灵骨葆为代表的中药制剂已逐渐在临床应用中得到重视。本研究提示仙灵骨葆可部分阻止去卵巢大鼠骨量丢失，其机制与降低骨转换水平，抑制骨吸收的同时促进骨形成有关进而维持骨量有关。

本研究中去卵巢大鼠表现出骨量下降，同时骨代谢状态指标提示骨吸收和骨形成活跃的高骨转换状态，与血、尿中骨代谢指标结果一致。仙灵骨葆可部分阻止骨量丢失，同时骨吸收指标显著下降，骨形成指标则显著上升。胫骨近段与股骨远端的共同点是松质骨含量较高，因此BMD与骨组织形态学检测结果均提示短期应用仙灵骨葆治疗大鼠OP的作用以松质骨骨量改善更为明显。生物力学结果提示去卵巢大鼠股骨的结构力学特性并未显著下降，仙灵骨葆组大鼠亦无显著改变，结合以往研究，OP大鼠股骨发生组织学改变的同时内径增大，抗弯能力相对增加，抵消了组织学退变导致的力学特性改变。综上，本研究提示仙灵骨葆灌胃给药可通过促进骨形成，抑制骨吸收，增加去卵巢大鼠骨量，减少其骨量丢失。

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