肾癌组织中MMP-2、MMP-9及VCAM-1的表达变化及意义

赵志红 倪晓辰 仇 炜 张爱莉 (河北医科大学附属第四医院泌尿外科，河北 石家庄 050011)

肾癌是我国常见的泌尿系统恶性肿瘤，其发病率近年有上升趋势。基质金属蛋白酶(MMPs)可通过降解细胞外基质(ECM)，促进恶性肿瘤的侵袭和转移〔1〕。MMP-2和MMP-9是MMPs家族成员，能够水解基底膜成分Ⅳ型胶原，促进肿瘤的浸润与转移。血管细胞黏附分子1(VCAM-1)参与多种细胞间的黏附，与肿瘤的浸润转移及免疫逃逸有密切关系。基于上述分子在恶性肿瘤进展中的重要作用，本研究通过检测并比较MMP-2、MMP-9和VCAM-1在肾癌及癌旁肾组织的表达情况，为肾癌的治疗和判断预后提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 肾癌患者随机取自我院于2009年4月至2010年2月在泌尿外科住院病人48例，其中男37人，女11人，年龄35～82岁，平均年龄(60.9±9.3)岁。所有患者术前均未进行治疗，经肾肿瘤根治性切除术后病理证实为肾透明细胞癌。所有患者均于术后取癌及癌旁肾组织。之后快速切取少量置于10%甲醛溶液中固定，其余组织立即投入液氮中保存备用。

1.2 主要试剂 兔抗 MMP-9、VCAM-1多克隆抗体，小鼠MMP-2、β-actin单克隆抗体均购自Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒及DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。

1.3 免疫组织化学方法 采用免疫组化S-P法检测，石蜡包埋后切成5 μm厚的切片，脱蜡复水，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，抗原热修复，正常山羊血清封闭，依次滴加一抗、二抗、辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液孵育，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片。以PBS代替一抗做阴性对照。光镜下观察，MMP-9、MMP-2及VCAM-1表现棕褐色或棕黄色阳性颗粒。半定量结果评定标准参考许良忠〔2〕等报道的方法，即染色强弱分数标准为:棕褐色3分;棕黄色2分;淡黄色1分;无着色0分。阳性细胞计数:一个视野内着色细胞＞75%为4分;51% ～75%为3分;11% ～50%为2分;≤10%计为1分;阴性为0分。两项得分乘积，0～3分为阴性表达“－”;3分以上为阳性表达“+”。

1.4 明胶酶图分析 称取约30 mg液氮冻存标本裂解后蛋白定量，各组均取20 μg蛋白与5×上样缓冲液 (0.1 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，20%甘油，0.1% 溴酚蓝，4%SDS) 混匀，上样于凝胶(含0.2%明胶)加样孔内。4℃条件下恒压(120 V)电泳2～3 h。电泳结束后，凝胶经2.5%Triton X-100漂洗三次，每次15 min，使明胶酶复性;弃去漂洗液，加入反应缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，50 mmol/L NaCl，10 mmol/L CaCl2)中，于37℃下温育过夜，使明胶酶充分水解凝胶中的明胶。之后经考马斯亮蓝染色、脱色液脱色至出现白色清晰条带。然后使用凝胶成像系统进行成像并进行灰度扫描。

1.5 Western印迹分析 取上述定量后蛋白裂解液20 μg与5×SDS上样缓冲液(0.1 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，20% 甘油，0.1%溴酚蓝，10% β-巯基乙醇，4%SDS)混匀，煮沸变性后经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。经转膜、5%脱脂牛奶封闭、一抗及二抗孵育和化学发光等检测β-actin的表达水平以作为上述明胶酶图的内参照，使用凝胶成像分析系统扫描其灰度值。

2 结果

免疫组化结果显示，肾癌组织结构排列紊乱，缺乏典型肾小管、肾小球等结构，MMP-2、MMP-9及VCAM-1阳性颗粒均呈典型的棕褐色颗粒，而癌旁组织则仅有散在的棕褐色颗粒 (图1)。MMP-2，MMP-9及VCAM-1免疫组化结果表明MMP-2、MMP-9及 VCAM-1在肾癌组织中表达升高 (P＜0.01) (表1)。明胶酶图结果显示，肾癌组织中MMP-2及MMP-9的明胶酶活性较癌旁组织明显升高 (P＜0.01)(图2，表1)。因此上述结果提示，MMP-2、MMP-9及VCAM-1在肾癌组织中表达水平增强，这些分子可能在肾癌的发生发展过程中起到重要作用。

图1 肾癌组织及癌旁组织中MMP-2、MMP-9及VCAM-1的表达变化(DAB，×100)

图2 MMP-2及MMP-9在肾癌及癌旁组织的活性变化(明胶酶图分析)

表1 MMP-2、MMP-9及VCAM-1在肾癌及癌旁组织中表达差异比较(n=48)

3 讨论

肾癌的组织类型包括透明细胞癌、乳头状腺癌、嫌色细胞癌、未分化癌等，其中透明细胞癌最为多见。肿瘤的浸润、侵袭及转移能力是恶性程度的生物学基础。在肿瘤的浸润侵袭过程中涉及多种细胞外基质与细胞分泌成分的相互作用。MMP-2及MMP-9是两种常见的ECM水解酶类，它们可以通过水解基底膜成分促进肿瘤细胞迁移与侵袭，因此它们是两种迁移相关蛋白，与肿瘤细胞的侵袭性有关。以往研究表明，MMP-2及MMP-9在多种肿瘤组织中高表达〔2～5〕，但这些研究主要通过免疫组织化学或Western印迹的方法对MMPs的表达量进行检测。本研究中采用灵敏度高、价格低廉的明胶酶图法进行检测，因此可以直接反映出肾癌组织中MMP-2及MMP-9的明胶酶活性。结果表明MMP-2及MMP-9活性的增高可能与肾癌的发病及恶性化密切相关。VCAM-1是一种细胞表面黏附分子，它是介导肿瘤免疫的重要分子〔6〕。本文结果显示，VCAM-1在肾癌组织中表达阳性率明显增加，因此推断VCAM-1的高表达与肾癌也有密切联系。

恶性肿瘤的个体化治疗是今后治疗手段改进的新趋势。检测每个病例肿瘤细胞特殊蛋白的表达谱对于评估疾病的特点及制定个体化治疗策略具有重要意义。对于肾癌组织中高表达某些特征性蛋白的患者，则可以通过药物或其他措施抑制这些特征性蛋白的表达以达到更好的治疗效果。因此，方便高效的检测手段是今后个体化治疗方案制定的前提。对于高表达上述肿瘤相关蛋白的患者，在术后应用药物干预这些蛋白的表达水平可能是降低肿瘤复发、延长患者生存率的有效手段。

1 Brassart B，Randoux A，Hornebeck W，et al.Regulation of matrix metalloproteinase-2(gelatinase A，MMP-2)，membrane-type matrix metalloproteinase-1(MT1-MMP) and tissue inhibitor of metalloproteinases-2(TIMP-2)expression by elastin-derived peptides in human HT-1080 fibrosarcoma cell line〔J〕.Clin Exp Metastasis，1998;16:489-500.

2 许良忠，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准〔J〕.中国癌症杂志，1996;6:229-31.

3 Liu Z，Li L，Yang Z，et al.Increased expression of MMP-9 is correlated with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma〔J〕.BMC Cancer，2010;10:270.

4 Gerstein ES，Sini L，Ryabov AB，et al.Comparative enzyme immunoassay of matrix metalloproteinases-2，-7，-9 and their tissue inhibitor-2 in tumors and plasma of patients with gastric cancer〔J〕.Bull Exp Biol Med，2009;148:899-902.

5 Alshenawy HA.Immunohistochemical expression of epidermal growth factor receptor，E-cadherin，and matrix metalloproteinase-9 in ovarian epithelial cancer and relation to patient deaths〔J〕.Ann Diagn Pathol，2010;14:387-95.

6 Wu TC.The role of vascular cell adhesion molecule-1 in tumor immune evasion〔J〕.Cancer Res，2007;67:6003-6.