肉牛牛支原体肺炎感染的细菌学研究

肖淦文，彭清洁，崔 朋，胡长敏，陈颖钰，巴晓亮，陈焕春，郭爱珍＊

（1.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北 武汉 430070；2.华中农业大学动物医学院，湖北 武汉 430070；3.武汉科前动物生物制品有限公司，湖北 武汉 430070；4.华中农业大学动物科技学院，湖北 武汉 430070）

牛支原体（Mycoplasma bovis，M.bovis）是严重危害世界养牛业的重要病原之一，主要引起肺炎和乳腺炎，此外还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎、流产与不孕等多种病症［1，2］。据报道，欧美国家约四分之一至三分之一的牛呼吸疾病综合征是由牛支原体引起的［3］。同时，牛支原体与其它病原的混合感染和协同致病是牛支原体肺炎重要的致病机制之一［4，5］。据报道，混合感染的常见病原菌主要包括：多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、化脓隐秘杆菌（A.pyogenes）、溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）、昏睡嗜血杆菌（H.somni）等［4］；混合感染的常见病毒有：牛副流感病毒3型（bovine parainfluenza－3virus，PI3V）、疱疹病毒Ⅰ型（bovine herpesvirus－1，BHV－1）、牛呼吸道合胞体病毒（bovine respiratory syncytial，BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）和牛冠状病毒（bovine coronaviirus，BCV）等［5］。但是，不同国家和地区甚至农场流行的菌株差异很大。自2008年以来，我国大部分省地区新从外地引进肉牛爆发了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎”疫情，多数牛在运输到目的地后1～2周左右发病，发病率为50%～100%，病死率高达10%～50%，给我国肉牛养殖业造成了巨大的经济损失［6］。此外，奶牛也有暴发牛支原体肺炎的报道［7，8］。本文归纳整理了2008年以来本实验室对牛支原体肺炎的细菌学研究结果，以期进一步阐明牛支原体肺炎的病原学特征，为临床治疗提供更多的参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料收集

2008年6月至2011年11月，采用门诊和出诊的方式，收集我国肉牛养殖场疑似牛支原体肺炎的病牛病料，以场为单位，每场给1个编号。病料分布见表1。

1.2 细菌培养与鉴定方法

无菌条件下采集患病牛鼻拭子、气管拭子和病变肺组织，分别涂抹接种于含无支原体新生牛血清（杭州四季青有限公司）的TSA（Tryptic Soy Agar，胰蛋白胨大豆琼脂）培养基平皿和PPLO（Pleuropneumonia－Like Organisms，类胸膜肺炎微生物）培养基平皿上。TSA平板于37℃培养8～16h，PPLO平板于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养72h。

表1 病料时间和地区分布情况

获得初始培养物后，用接种环挑取优势菌的单菌落转接相同培养基，进行纯培养。进一步通过革兰氏染色鉴定、16SrDNA通用引物的PCR扩增和测序鉴定、特异性PCR检测等，确定混合感染菌种类。

PCR扩增16SrDNA的通用引物及扩增条件参考文献［6］，引物序列如下：

P1：5＇AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG3＇

P2：5＇GGT TAC CTT GTT ACG ACT T3＇

在16SrDNA测序鉴定后，进一步用牛支原体uvrC基因的特异性引物进行牛支原体的鉴定［7］。

在16SrDNA测序鉴定后，进一步根据文献报道方法，用特异性PCR鉴定巴氏杆菌A和B型［8］。

在16SrDNA测序鉴定后，进一步用化脓隐秘杆菌的16SrRNA基因的特异性区段设计引物进行鉴定［12，13］。

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，PCR扩增所用试剂也购自该公司。

2 结果与分析

2.1 临床症状和病理变化

所有病牛均具有相似的流行病学背景，牛只购进不久就开始出现临床症状，发病初期体温升高至41～42℃，病牛精神沉郁，食欲减退，咳嗽、气喘，早晚或气温转凉时咳嗽加剧，有清亮或脓性鼻汁，严重者进食停止；随着病情发展患牛明显消瘦，被毛粗乱，逐渐出现拉稀，甚至血便；有的患牛继发关节炎，表现跛行、关节脓肿等症状；有的病牛继发结膜炎，眼结膜潮红，有大量浆液或脓性分泌物；后期肺部听诊呈湿啰音，严重病牛极度消瘦衰竭死亡，犊牛病情相对严重，病死率可达50%。

对来自全国不同地区的35个养殖场的123例病牛的临床症状进行归纳，结果发现85.71%的场以呼吸道症状为主，只有14.29%表现更为严重的腹泻症状（表2）。

表2 疑似牛支原体肺炎病牛的临床症状类似

2.2 大体病理变化

解剖病理变化主要表现在胸腔和肺部，其他脏器一般不表现病变，轻者肺脏可见尖叶、心叶及部分膈叶的局部红色肉变，或同时有化脓灶散布；严重者肺脏质地变硬并和胸膜发生不同程度粘连，表面有大小不等灰白或黄色干酪样坏死灶（图1左），或白色化脓灶（图1右）；气管、支气管内有干酪样分泌物或乳白色泡沫，胸腔有少量积液，纤维蛋白渗出；心包积水，液体呈清亮黄色。

图1 牛支原体肺炎病牛肺病变

2.3 细菌学检测结果

对35个发病牛场的123例病牛的组织样本进行了细菌学检测。各组织样本中，以肺脏分菌率最高。牛支原体是分离率最高的致病菌，在各组织样本中，以肺中牛支原体分离率最高，其次是喉拭子，鼻拭子分离率最低。

除牛支原体外，混合感染的细菌有9种。各病原菌的分离率为：牛支原体74%，多杀性巴氏杆菌17%，化脓隐秘杆菌14%，葡萄球菌9%，变形杆菌6%，溶血曼氏杆菌、化脓链球菌、奈瑟菌和地衣芽孢杆菌均为3%。所分离的多杀性巴氏杆菌全部为A型。发生关节炎的牛关节感染了化脓链球菌。此外，在肺中大肠杆菌分离率为19%，血清型待定（表3）。

在牛支原体分离阳性的26个牛场中，除大肠杆菌外，以牛支原体合并多杀性巴氏杆菌A型感染（混合感染4次）、牛支原体合并化脓隐秘杆菌感染为主（5次分离A.P均为混合感染），另有2个场只检出多杀性巴氏杆菌A型而未检出牛支原体。其它7个场未分到明显的优势菌，分别为葡萄球菌、溶血曼氏杆菌、副流感3型病毒和病毒性腹泻病毒感染。

表3 牛支原体肺炎病牛细菌学检测结果

3 讨论

从流行病学调查结果发现，各个发病场情况类似，牛群在1～2周左右逐渐出现牛只体温上升，食欲减退，呼吸系统症状是牛运输后发病的主要症状，首先为咳嗽、气喘，随后腹泻、甚至血便，出现关节炎，后期病牛极度衰竭或呼吸困难，导致死亡。因此，长途运输带来的各种应激因素无疑对疾病有促进作用，这些应激因素包括冷、热、饥、渴、颠簸、疲劳、拥挤以及新场的陌生环境等。减少运输应激能降低发病率［9］，但不能阻止发病。因此，特异性病原在牛运输后发病中起着决定性作用。

虽然，牛支原体是导致我国肉牛运输后发生肺炎的主要病原已成共识［1－6］，但临床上混合感染现象时常发生。而混合感染常使疾病加剧，症状复杂化，甚至预后不良。各个国家或地区分离鉴定的混合感染病原差异较大［4，11］，本研究揭示多杀性巴氏杆菌A型和化脓隐秘杆菌是最常见的两种混合感染细菌。

多杀性巴氏杆菌是牛“船运热肺炎”病变肺中最常分离出的细菌，最常见的血清型为A∶3，正常情况下可共栖于牛的鼻咽部。单纯感染较少见，常与溶血曼氏杆菌（M.haemolytica）和嗜昏睡杆菌（H.somni）、牛支原体和呼吸道病毒等混合感染。典型病变表现为支气管肺炎，呈急性、亚急性或慢性纤维素性化脓性或纤维素性坏死性病变［10］。

化脓隐秘杆菌是致牛脓肿的常见病原菌，常在慢性支气管肺炎部位发生严重的化脓性肺炎病变。犊牛可从母亲获得感染，通过入侵上皮细胞、在巨噬细胞内存活和形成生物膜等逃避免疫反应［11］。

关于牛支原体分离率，本研究的分离率为74%与前期研究90%以上的分离率有差距［6］。牛支原体分离率偏低可能与样本采集与分菌时取样部位有关，据技术员发现，取肺病健交界部位进行牛支原体分离的成功率最高；或者可能与样本采集时间也有关，采集时间距牲畜死亡时间过长可能导致病原菌分离率降低。

基于牛支原体肺炎混合感染的复杂情形，临床上对病料进行细菌学分离与耐药检测，确定混合感染病原与敏感药物，将对临床治疗具有重要意义。

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