人肺腺癌细胞A549耐药细胞系的建立及意义

刘利则 夏 莉 段北野 刘玉侠 (吉林省人民医院，吉林 长春 3002)

尽管少数早期肺癌患者可以通过手术治疗达到根治的效果，但70%的非小细胞肺癌(NSCLC)患者确诊时已属临床晚期，无法通过手术治愈。含铂类双药化疗方案是晚期NSCLC标准的一线化疗方案，其中顺铂(cDDP)是使用广泛的化疗药物之一〔1〕。但是随着治疗的进行，肿瘤细胞会对化疗药物产生耐药，这是造成化疗疗效不佳及失败的主要原因之一〔2〕。如何保持肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是广大肿瘤工作者研究的课题。本实验拟建立人肺腺癌A549耐药细胞系，为药物逆转细胞耐药提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 IMDM培养基:Gibco产品;噻唑蓝(MTT):Sigma产品;胎牛血清:天津TB公司;二甲基亚砜(DMSO):Sigma产品;顺铂:购于江苏豪森药业股份有限公司;琼脂糖、DNA标准品:宝泰克公司产品。

1.1.2 人肺腺癌细胞系A549 购于上海生命科学研究院。

1.1.3 主要设备及器材 低温低速离心机，SORVALL RTT，USA;全自动酶标仪，Labsystems Dragon;万能视频成像系统(LY-WN-HPCCD)都励扬精密机电有限公司。

1.2 实验方法.

1.2.1 细胞复苏与培养 将A549细胞从液氮罐中取出复苏后，加入含10%FCS的IMDM培养液接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下静止培养。次日更换培养液，继续培养。

1.2.2 耐药细胞株A549/cDDP建立 当细胞处于指数生长期且已铺满瓶底80%以上时，弃去原来培养液，加入含顺铂培养液(终浓度为100 μmol/L)，培养1 h后弃去含顺铂培养基，更换为新鲜配制的含10%FCS的IMDM培养液，置于CO2培养箱中继续培养。观察细胞生长状态，拍照。待细胞长满瓶时，用0.25%胰酶消化传代。再长满瓶底时再用同样浓度同样方法冲击，再培养并观察细胞生长状态，拍照，再传代。如此，体外连续培养、冲击、传代，并同时进行抗药性检测。反复冻存，复苏，观察细胞株生长稳定性。

1.2.3 MTT法检测细胞抗药性 复苏人肺腺癌细胞株A549和经过顺铂冲击处理的A549/cDDP细胞，用含10%FCS的IMDM培养液重悬，置于CO2培养箱中，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下静止培养。次日更换培养液，继续培养。当细胞生长至指数生长期时，0.25%胰酶消化，生理盐水洗涤，计数。用含10%FCS的IMDM培养液重悬，调整细胞密度为5×104/ml，加入 96 孔培养板，100 μl/孔，置于 CO2培养箱中，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下静止培养过夜，细胞贴壁后加入受试药物cDDP，终浓度分别是 200、100、50、25、12.5、6.25 μmol/L，同时设阴性对照(以等体积的生理盐水代之)和空白对照(无细胞)。各组设6复孔。37℃、5%CO2，饱和湿度条件下静止培养72 h后加入 MTT(5 mg/ml)，20 μl/孔，继续培养4 h，小心吸弃培养上清。加入DMSO，150 μl/孔，振荡10 min，使结晶物全部溶解后，用全自动酶标仪检测各孔吸光度值(A)，波长为492 nm。求出不同浓度cDDP对两种细胞的抑制率。计算公式:抑制率=〔1－(实验组均值/阴性对照组均值)〕×100%;计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度(IC50)和耐药指数(RI)。RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

1.2.4 A549顺铂耐药细胞基因检测 检测多药耐药基因特异序列(167 bp)的表达，用PCR扩增法。引物设计:上游CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG，下游GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA。PCR扩增:在离心管内加入下列内容物:10倍缓冲液，2.5 μl;MgCl2，2.5 μl;dNTP(2 mmol/L)，2.5 μl;引物，1.0 μl;DDW，14.0 μl;Target，2.0 μl;95℃，5 min 后加 Tag，0.5 μl。94℃，30 s;55℃，60 s;72℃，70 s;共 30 个循环，72℃ 延伸10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测多药耐药基因特异片段(167 bp)。

2 结果

2.1 细胞生长状态及生长特征 细胞在接受大剂量cDDP冲击后，出现大量死亡细胞，活细胞数锐减;生长缓慢，出现单个细胞克隆，层叠生长，传代后恢复单层排列。再次大剂量冲击后残存细胞再次层叠生长，传代后依然恢复单层排列。A549细胞经大剂量cDDP反复冲击后，细胞生长变缓慢，细胞体积变大，边界清楚。见图1。

图1 经大剂量cDDP冲击后细胞生长状态

2.2 不同次数cDDP冲击后细胞耐药性测定结果 分别检测经大剂量cDDP冲击10次和12次以后，不同浓度cDDP对亲本细胞和耐药诱导细胞的生长抑制情况。见表1，表2。冲击10次时对照组和 A549细胞的 IC50分别为24.33、65.65 μmol/L，RI为2.7;冲击12次时对照组和 A549细胞的IC50 分别为 19.61、81.58 μmol/L，RI为 4.2。

2.3 多药耐药基因特异片段(167 bp)的检测结果 见图2。从电泳结果可见，在167 bp附近有一条泳带。证明提取人肺腺癌细胞A549顺铂耐药细胞有多药耐药特异基因的表达。

表1 大剂量cDDP冲击10次后A549/cDDP细胞的药物检测(±s)

表1 大剂量cDDP冲击10次后A549/cDDP细胞的药物检测(±s)

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表2 大剂量cDDP冲击12次后A549/cDDP细胞的药物检测(±s)

表2 大剂量cDDP冲击12次后A549/cDDP细胞的药物检测(±s)

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图2 琼脂糖凝胶电泳检测多药耐药基因PCR扩增片段

3 讨论

目前，晚期NSCLC一线标准化疗方案是两种三代含铂药物联合。顺铂具有类似烷化剂双功能基团，与细胞内亲核基团结合，主要与DNA链上的碱基作用，改变其正常复制模板的功能，引起DNA复制障碍，从而抑制癌细胞分裂。

多药耐药是指肿瘤细胞对结构和功能不同的多种药物都产生了耐药。多药耐药的发展源于单用高剂量给药或联合用药后存活下来的部分细胞〔3，4〕。根据这一原理，本实验通过用顺铂反复冲击人肺腺癌A549细胞，建立人肺腺癌A549顺铂耐药细胞系，为药物逆转耐药细胞提供实验基础。

本文结果证明，经10次和12次冲击后，A549细胞对顺铂具有较强的耐受力，A549/DDP耐药细胞内有耐药基因的表达。因此，本实验建立了A549/DDP耐药细胞株。该细胞株通过反复冻存、复苏后，仍能高表达耐药基因，具有很好稳定性，为药物逆转实验奠定了基础。

1 Triano LR，Deshpande H，Gettinger SN.Management of patients with advanced non-small cell lung cancer:current and emerging options〔J〕.Drugs，2010;70(2):167-79.

2 Aandrews J，Yeh P，Pao W，et al.Molecular predictors of response to chemotherapy in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer J，2011;17(2):104-13.

3 Jabr-Milanc LS，van Vlerken LE，Yadav S，et al.Multi-functional nanocarriers to overcome tumor drug resistence〔J〕.Cancer Treat Rev，2008;34(7):592.

4 Meijerman I，Beijnen JH，Schellens JH，et al.Combined action and regulation of phageⅡenzymes and multidrug resistence proteins in multidrug resistence in cancer〔J〕.Cancer Treat Rev，2008;34(6):505.