鸡眼草总黄酮的提取工艺条件及其体外抗氧化性

王春景 胡小梅 刘高峰 李 晶 (蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233000)

鸡眼草蝶形花科鸡眼草属的一年生草本植物，俗称掐不齐、人字草等，生于路边、林下、田野、山地、丘陵。鸡眼草具有抗炎镇痛〔1，2〕、止血〔3〕等生物活性，用于治疗婴幼儿迁延性慢性腹泻疗效显著〔4〕，对 IgA肾病模型大鼠具有一定的治疗作用〔5〕，鸡眼草也是国内苗医用于骨伤疾病的苗族药物之一〔6〕。鸡眼草含有芹菜素、槲皮素、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖苷、山萘酚－7－O－β－D－葡萄糖苷、芹菜素－7－O－新橙皮糖苷等黄酮类化合物〔7〕，鸡眼草黄酮类化合物具有抑制白细胞介素－5的生物活性〔8〕。已有研究表明很多植物黄酮类化合物具有较强的清除自由基等抗氧化作用〔9～11〕，关于鸡眼草总黄酮的提取工艺研究及其抗氧化活性研究均未见具体报道，本文研究了鸡眼草总黄酮的提取工艺条件及其体外抗氧化活性，以期为鸡眼草黄酮类化合物的进一步开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 芦丁:南京替斯艾么中药研究所;邻苯三酚Amersco公司分装;Tris Feinbiochemica Heidelberg公司;抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒、总抗氧化能力(T－AOC)测定试剂盒:南京建成生物工程研究所;乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、NaOH、NaNO2、Al(NO3)3、水杨酸、H2O2、FeSO4、盐酸等均为国产分析纯。实验材料鸡眼草九月中旬采于蚌埠市郊区。UV－1800紫外/可见分光光度计:北京瑞利分析仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮的提取工艺

1.2.1.1 提取方法 鸡眼草65℃烘至恒重后粉碎，乙醇浸提，蒸干所得浸膏用温蒸馏水混悬，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取部，蒸干得鸡眼草粗黄酮粉。

1.2.1.2 总黄酮含量的测定〔12〕精密称取芦丁0.01 g，用体积分数 30%的乙醇溶解并定容至 100 ml，配成浓度为0.1 mg/ml的芦丁标准液，吸取芦丁标准液 0、1、2、3、4、5、6、7、8 ml于9支刻度试管中，分别加0.3 ml 5%NaNO2，摇匀，静置6 min;再加10%Al(NO3)30.3 ml，摇匀，静置6 min;再加入 4%NaOH 4 ml，用 30% 乙醇定容至 10 ml，摇匀，静置 15 min，以 0浓度为参比，波长510 nm测吸光度，将芦丁浓度与吸光度进行线性回归得标准曲线:A=15.617c－0.004 1，R2=0.999 8。样品中的黄酮含量测定方法为:将所得粗黄酮粉用适量30%乙醇溶解后，取1 ml，按上述标准曲线制作的方法测定吸光度，再由标准曲线计算出黄酮浓度。

1.2.1.3 单因素实验 选取温度、乙醇浓度、料液比和时间4个因素分别做单因素实验，考察它们对总黄酮得率的影响。具体为:分别称取鸡眼草粉末1 g，按料液比1∶30、65%的乙醇、提取3.0 h，考察不同提取温度(55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃)对其总黄酮得率的影响;以料液比 1∶30、65℃、提取3.0 h，考察不同乙醇浓度(50%、55%、60%、65%、70%、75%)对其总黄酮得率的影响;按65℃、65%的乙醇、提取3.0 h，考察不同料液比(1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55)对其总黄酮得率的影响;以料液比1∶30、65℃、65%的乙醇，考察不同提取时间(2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h)对其总黄酮得率的影响。

1.2.1.4 正交试验设计 在以上单因素实验的基础上，每因素选取3个水平，设计L9(34)正交试验，从而确定最佳提取工艺条件，各因素水平设计见表1。

表1 正交试验因素水平设计

1.2.2 抗氧化活性测定

1.2.2.1 羟自由基(·OH)清除实验〔13〕水杨酸法，向反应体系中分别加入6 mmol/L FeSO4溶液2 ml、6 mmol/L水杨酸－乙醇溶液 2 ml、浓度为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/ml的黄酮液 2 ml，摇匀，再各加入 6 mmol/L H2O22 ml，用蒸馏水定容至10 ml，摇匀，37℃水浴30 min，以蒸馏水为参比，510 nm测定各吸光度Am，同样方法测定不加黄酮液的吸光度A0，不加H2O2各黄酮液的本底吸光度An。

1.2.2.3 抗超氧阴离子自由基(?)活力实验 按照测定试剂盒的操作方法进行实验，抗?活力单位定义为:在反应体系中，每毫升黄酮液在37℃反应40 min所抑制的相当于1 mg的维生素C所抑制的的变化值为一个活力单位。

1.2.2.4 总抗氧化能力(T－AOC)测定 按照测定试剂盒的操作方法进行实验，T－AOC单位定义为:在37℃时，每分钟每毫升黄酮液使反应体系的吸光度值每增加0.01时，为一个总抗氧化能力单位。

1.3 统计学方法 采用方差分析进行组间比较。

2 结果

2.1 单因素实验结果 由图1可知，随着温度升高，总黄酮得率随之提高，75℃时又有所降低，故选择60℃、65℃、70℃作为正交试验温度的优化水平。由图2可看出，乙醇浓度为55%时总黄酮得率最高，随着乙醇浓度的增加，总黄酮得率又有所下降，并趋于平稳，故选择55%、60%、65%作为进一步提取优化的条件。由图3可知，提取时间为2.5 h和3.0 h时，总黄酮得率基本无变化，随着提取时间的进一步延长，总黄酮得率呈下降趋势，故选择2.5 h、3.0 h、3.5 h作为进一步提取优化选择的条件。图4表明，随着料液比的增加，总黄酮得率亦随之增加，特别是1∶40～1∶50时增加较快，随后又趋于平稳，故选择1∶40、1∶45、1∶50作为正交试验料液比的进一步优化水平。

2.2 正交试验结果与分析 正交试验结果表明(表2)，提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比4因素对鸡眼草总黄酮得率的影响为大小为:料液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓度(即D＞A＞C＞B)，最佳提取工艺条件为:A3B1C1D3，即提取温度为70℃、乙醇浓度为55%、提取时间为2.5 h、料液比为1∶50时，鸡眼草总黄酮的提取得率最高。进一步方差分析表明(表3)，试验选取的4因素的3个水平，提取温度、乙醇浓度和提取时间这3因素的3个水平对鸡眼草总黄酮得率的影响差异不显著(P＞0.05)，料液比的3水平间差异显著(P＜0.05)。通过各因素的F值看出FD＞FA＞FC＞FB，这与表2直观得出的4因素影响大小(D＞A＞C＞B)结果是一致的。

表2的正交试验设计中不包括最佳提取工艺条件A3B1C1D3，需追加实验进行验证。将5份鸡眼草粉末按提取温度为70℃、55%乙醇、料液比为1∶50、提取2.5 h，计算总黄酮得率为(2.10±0.95)%。在A3B1C1D3条件下，鸡眼草总黄酮得率高于表2设计的各组合，所以按A3B1C1D3条件提取鸡眼草总黄酮，得率较高，且实验稳定性也较强。

表2 正交试验设计及结果

表3 正交实验结果方差分析

2.3 体外抗氧化性结果

2.3.1 对·OH的清除作用 由图5可看出，随着鸡眼草总黄酮浓度的升高，·OH的清除率逐渐增加，且其浓度与清除率之间存在一定的量效关系。将浓度与清除率进行线性回归，利用回归方程求出当清除率为50%时的浓度，即其半数清除浓度(EC50)为 3.17 mg/ml。

2.3.4 总抗氧化能力 随着鸡眼草总黄酮浓度的增加，其总抗氧化能力单位亦随之增大 (见图6)，表明其总抗氧化能力逐渐增强，这可能与其能够清除·OH和 等自由基是相关的。观察〔J〕. 现代中西医结合杂志，2010;19(5):553－4.

图1 提取温度对鸡眼草黄酮得率的影响

图2 乙醇浓度对鸡眼草黄酮得率的影响

图3 提取时间对鸡眼草黄酮得率的影响

图4 料液比对鸡眼草黄酮得率的影响

图5 鸡眼草总黄酮对·OH和的清除效果

图6 鸡眼草总黄酮抗活力和总抗氧化能力

3 讨论

单因素实验及正交试验结果表明，提取温度、乙醇浓度、提取时间、料液比4因素对鸡眼草总黄酮得率的影响为大小为:料液比＞提取温度＞提取时间＞乙醇浓度，最佳提取工艺条件为:提取温度为70℃、乙醇浓度为55%、提取时间为2.5 h、料液比为1∶50，按此工艺条件提取，鸡眼草总黄酮的提取得率约为2.10%。该提取工艺条件简单易行，且重现性较好。鸡眼草总黄酮对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除作用，其清除率与浓度间存在一定的量效关系。鸡眼草总黄酮抗超氧阴离子自由基活力单位和总抗氧化能力单位亦随着其浓度的增加而增加，均表明鸡眼草总黄酮具有一定的体外抗氧化活性，可考虑将其黄酮类化合物开发为抗氧化保健食品或生物制品，从而促进鸡眼草的进一步开发利用。

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