同步监测蟾蜍心脏机械和电活动简便而有效的方法*

2012-07-31李秀国张民锋朴日龙李迎军

中国病理生理杂志 2012年2期

李秀国，张民锋，朴日龙，李迎军

(延边大学1基础医学院，2药学院，吉林延吉 133002)

观察心肌收缩力、心率和心输出量等心肌机械活动的变化，以及监测心电图的变化对于研究各种生理或病理因素对心脏功能的影响，以及心血管药物的开发具有重要意义。现有很多观察心脏功能的实验方法，都有各自的特点。离体Langendorff心脏灌流法、离体乳头肌实验法、心房肌实验法等能够模拟哺乳动物心肌收缩，兔在体不破坏胸膜记录心收缩力的方法能够同时观察心肌收缩力和心电图的变化，但实验设备和技术条件要求较高［1－2］。利用变温动物离体心脏为实验对象进行的Straub's法和八木－Hartung法蛙心插管［3］能够直观地观察整体心脏收缩，具有简单、易行，不需恒温和供氧设备，心脏活动不受神经体液调节等优点。宋士军等［4］的实验方法利用在体蟾蜍心脏同步观察了心脏的机械性活动和心电图的变化。在同一实验个体中能够同步观察多个实验参数不仅能够减少实验经费，其实验结果会更可靠。本实验制作了蟾蜍离体原位自发性搏动心脏灌注模型，用于同步监测心输出量、心肌舒缩张力和心电图。通过灌注β受体激动药异丙肾上腺素和其拮抗药普萘洛尔，验证了该实验方法的可行性。

材料和方法

1 材料

蟾蜍，雌雄混用，体质量50～70 g，延边大学实验动物科提供。BL－420S生物机能实验系统和张力换能器以及标准肢体心电图Ⅱ导联线(四川成都泰盟科技有限公司)，异丙肾上腺素、普萘洛尔(Sigma Chemical Co.)，任氏液为标准配方。

2 方法

2.1 模型制备(图1) 蟾蜍毁脑毁髓，背位固定在蛙板上。打开胸腹腔，暴露心脏和相连大血管。分离左右主动脉干，结扎右主动脉，左主动脉穿线备用。上提左右主动脉，钝性分离后腔静脉，并在其下穿2条线，1条从静脉窦下方结扎后腔静脉和动脉干以外的其它血管，1条备用。向左翻开肝脏右叶，分离肝静脉并轻轻提起，将装有任氏液的连接三通管和5 mL注射器的硅胶管(外径2 mm，内径1.5 mm)从肝静脉经后腔静脉插入右心房约1.5～2.0 mm。打开三通管，并注入少量任氏液，进一步确定硅胶管进入位置。用备用丝线结扎固定插入后腔静脉的硅胶管头端(注意保持管道的通畅，不能有扭曲或反折，以免影响液体流出)。在三通管的垂直入口上连接储液瓶(10 mL注射器管制成)，打开储液瓶与注射器之间的通道，推注注射器内的任氏液进入储液瓶，排出三通管内残留气体。打开储液瓶与硅胶管之间的通道，向后腔静脉输入任氏液清洗心脏积血。将肝脏和心脏放回原位。提起左主动脉干，做一“V”形切口。将另一个硅胶管从切口向心脏方向插入至近动脉圆锥处，用备用丝线结扎固定(硅胶管尖端平切，利于液体流出)。回收流出液至储液瓶。用无创蛙心夹夹住心尖并与张力换能器连接。调节储液瓶液面高度(前负荷)为3 cmH2O，流出管口高度(后负荷)为10 cmH2O。观察液体流出量，确定有无漏液。向蟾蜍右侧头端牵拉结扎左右腔静脉等的丝线并固定，调节蛙心夹与滑轮的水平连线，使蟾蜍心尖保持水平向下偏左。肢体皮下插入针状电极，利用BL－420S系统记录心脏的张力和标准肢体Ⅱ导联心电图。稳定30 min，调节张力换能器，使心肌在舒张期末的张力维持在1.0 g左右。待蟾蜍心脏收缩曲线平稳后，记录心输出量、心肌舒缩程度和幅度，以及心电图PR间期、QT间期、QRS波群电压和时间等，作为自身对照。

Figure 1.A schematic diagram simultaneously detecting the cardiac contractility and electrocardiogram(ECG)on the separated in situ spontaneously beating toad heart perfusion model.a:container for perfusion;b:3－way stopcock;c:syringe for rapid application of Ringer's solution or empty the gas in the inflow cannula;d:inflow cannula;e:aortic cannula(outflow cannula);f:force transducer;g:standard limb leadⅡ;h:BL－420S data acquisition and analysis system.图1 同步监测蟾蜍离体原位自发性搏动心脏灌流模型的机械性和电活动示意图

2.2 利用灌流模型观察异丙肾上腺素对心脏活动的影响在对照条件下，用10－5g/L异丙肾上腺素溶液置换储液瓶中的任氏液，待曲线平稳后，记录以上参数。之后，依次用5×10－5g/L、10－4g/L异丙肾上腺素溶液置换储液瓶中液体，在曲线平稳时记录以上参数。

2.3 利用灌流模型观察普萘洛尔对异丙肾上腺素作用的影响用含10－4g/L异丙肾上腺素和含10－4g/L普萘洛尔的混合溶液置换10－4g/L异丙肾上腺素溶液，在曲线平稳时记录以上参数。之后依次用含10－4g/L异丙肾上腺素与含5×10－4g/L和10－3g/L普萘洛尔混合溶液置换后，在曲线平稳时记录以上参数。

3 统计学处理

结果

1 离体原位心脏机械性活动和相应心电图表现

在灌注任氏液的条件下，蟾蜍离体原位自发性搏动心脏张力和心电图曲线见图2，具体参数见表1。通过记录出液管中的流出滴数，方便地记录到心输出量的变化(1 mL=20 drop);通过张力曲线图能够监测到心脏收缩和舒张程度、舒缩幅度;心电图曲线中的PR间期、QT间期、QRS波群时间和电压等显示清楚，利于分析心脏机械性活动和电生理变化的相关性。

Figure 2.The curves of cardiac force and electrocardiogram simultaneously recorded from the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve;B:ECG curve.图2 同步记录蟾蜍离体原位自发性搏动心脏的张力和心电图曲线

表1 普萘洛尔对异丙肾上腺素所致的蟾蜍离体原位自发性搏动心脏活动的影响Table 1.The effects of isoproterenol on the cardiac activities of the separated in situ toad hearts in the presence or absence of propranolol(.n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs pretreatment;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs 10－4g/L isoproterenol.

Parameters Pretreatment isoproterenol(g/L)10－4g/L isoproterenol+propranolol(g/L)10－5 5×10－5 10－4 10－4 5×10－4 10－3 Cardiac output(mL/min) 2.66±0.78 2.99±0.64＊＊ 3.43±0.37* 3.62±0.32* 3.04±0.48△△ 2.37±0.76△△ 1.89±0.79△△Maximum force(g) 1.91±0.25 1.95±0.32 1.98±0.33 2.13±0.42 1.70±0.19△△ 1.50±0.19△△ 1.38±0.16△△Minimum force(g) 0.98±0.03 0.93±0.04＊＊ 0.81±0.05＊＊ 0.78±0.07＊＊ 0.76±0.05 0.78±0.06 0.79±0.07 Force range(g) 0.93±0.26 1.01±0.34 1.17±0.35 1.35±0.43＊＊ 0.94±0.19△△ 0.72±0.19△△ 0.59±0.17△△PR interval(ms) 323.33±54.49 305.00±57.28 ＊＊ 284.44±41.64＊＊ 283.89±48.98＊＊ 300.56±49.90 346.67±59.63△△ 371.11±59.57△△QRS width(ms) 160.00±14.58 168.33±27.39 162.78±18.73 174.44±21.42 175.00±22.91 186.11±20.43 202.22±18.05△△QT interval(ms) 772.22±205.97 793.89±193.71 991.11±210.64* 1082.78±220.77＊＊ 927.33±232.16△ 771.67±186.21△△ 744.44±144.86△△R wave amplitude(mV) 0.056±0.024 0.063±0.032 0.061±0.023 0.073±0.028* 0.061±0.025△ 0.046±0.015△△ 0.037±0.015△△R and S wave amplitude(mV) 0.089±0.038 0.103±0.054 0.144±0.155 0.114±0.036* 0.099±0.039△ 0.082±0.025△△ 0.076±0.023△△Heart rate(min－1) 30.20±6.79 30.98±6.24 28.91±5.69 30.16±6.56 30.76±6.25 27.30±4.32 24.72±3.70△

2 异丙肾上腺素对离体原位心脏活动和心电图的影响

离体原位心脏灌流模型中，异丙肾上腺素对心脏活动和心电图的影响见图3、表1。与给药前相比较，在10－5～10－4g/L浓度范围内，随着异丙肾上腺素浓度的增加，心输出量逐渐增多(P＜0.05，P＜0.01)，最大张力逐渐增大，最小张力逐渐变小(P＜0.01)，心肌舒缩幅度逐渐变大(10－4g/L时，P＜0.05)。在心电图中表现为，心率无显著变化，但PR间期逐渐缩短(P＜0.01)，QT间期逐渐延长(P＜0.05，P＜0.01)，R波和 R+S波电压逐渐增大(10－4g/L时，P＜0.05)。

3 普萘洛尔对异丙肾上腺素作用的影响

离体原位心脏灌流模型中，普萘洛尔对异丙肾上腺素作用的影响见表1、图4。与10－4g/L异丙肾上腺素作用相比较，在10－4～10－3g/L浓度范围内，随着普萘洛尔浓度的增加，心输出量逐渐减少(P＜0.01)，最大张力逐渐变小(P＜0.01)，最小张力无明显变化，心肌舒缩幅度明显变小(P＜0.01)。在心电图中表现为，心率逐渐变慢(10－3g/L时，P＜0.05)，PR间期逐渐延长(P＜0.01)，QRS波群时间逐渐延长(10－3g/L时，P＜0.01)，QT间期逐渐变小(P＜0.05，P＜0.01)，R波和R+S波电压逐渐变小(P＜0.05，P＜0.01)。

Figure 3.Effects of isoproterenol on the cardiac force and ECG of the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve.B:ECG curve;a:perfused with 10－5g/L isoproterenol;b:perfused with 5 ×10－5g/L isoproterenol;c:perfuse with 10 －4g/L isoproterenol.图3 异丙肾上腺素对蟾蜍离体原位自发性搏动心脏张力和心电图曲线的影响

Figure 4.Effects of propranolol on isoproterenol(10－4g/L)－induced cardiac activities of the separated in situ spontaneously beating toad hearts.A:cardiac force curve.B:ECG curve;a:perfused with 10 －4g/L isoproterenol and 10 －4g/L propranolol mixture;b:perfused with 10－4g/L isoproterenol and 5 ×10－4g/L propranolol mixture;c:perfused with 10－4g/L isoproterenol and 10 －3g/L propranolol mixture.图4 普萘洛尔对异丙肾上腺素所致的蟾蜍离体原位自发性搏动心脏活动的影响

讨论

本实验利用蟾蜍离体原位自发性搏动心脏模型同步监测了灌注正常生理盐溶液条件下的心输出量、心肌舒缩张力和心电图。如图2所示，通过心脏搏动张力曲线能够记录到心脏节律性舒缩程度、幅度和节律，标准肢体II导联心电图波形曲线可记录到P波、QRS波群的幅度和时间、PR间期和QT间期等;2种曲线同时监测，利于分析二者间的相关性。该实验结果与宋士军等［4］的实验结果一致，能够观测到心房和心室的搏动波，且P波和QRS波群早于心房收缩波和心室收缩波。实验发现，流入管和流出管管径大小对实验结果有较大的影响;管道过细导致液体循环受阻，影响心脏功能，过粗不利于插管，易导致手术失败。经参照McKean等［5］的方法和反复实验，流出管和流入管均用了外径2 mm和内径1.5 mm的硅胶管。通过实验发现，体重在50～70 g之间的蟾蜍心脏耐受性较好。40 g以下或100 g以上易出现心脏增大变形、心率减慢、心律不齐，甚至出现房室瓣关闭不全导致液体逆流等现象。心电图是从体表记录到的心脏在每一心动周期所产生的电活动变化曲线图形。由体表所采集到的心电位强度，与探查电极的方位和心肌除极或复极方向所构成的角度有关;夹角愈大，心电位在某导联轴上的投影愈小，电位愈弱。心尖和探查电极的位置相对固定，利于得到相对稳定的心电图波形。由于受各种因素的影响，暴露的蟾蜍心尖所处的位置并不完全一致。为使得到的心电图相对稳定，易于记录各波的幅值，在本实验过程中要求:(1)蛙心夹的系线应尽量水平牵拉，使心脏不离开胸腔;(2)将系线拉向蟾蜍的左后肢方向，并用结扎左右腔静脉等的结扎线拉向与之反向的蟾蜍头部右上方。这样得到的心电图中各种波形明显，QRS波群的主波方向向上，利于监测各个波形振幅和间期;同时，可以防止左右主动脉因受牵拉变形导致灌流液流出受阻。

通过灌注β受体激动药异丙肾上腺素和其拮抗药普萘洛尔发现，该实验模型能够较好地显示异丙肾上腺素的正性肌力作用和普萘洛尔的拮抗作用。在灌注异丙肾上腺素时，随着其浓度的增加，心输出量逐渐增多，收缩张力逐渐增大，舒张张力逐渐变小，舒缩幅度逐渐变大，显示了异丙肾上腺素不仅使心肌收缩力增强，同时使舒张程度增加的作用。在心电图中表现为PR间期逐渐缩短，QT间期逐渐延长，QRS波群时间无明显变化，即房室传导加快，心脏的舒张期相对延长，进一步证实了异丙肾上腺素能够使心室舒张程度增加。与郑广华等［6］的实验结果相似，异丙肾上腺素对一些蟾蜍心脏具有正性频率作用，而对其它蟾蜍心脏无正性频率作用，统计结果未显示正性频率作用。在灌注异丙肾上腺素和普萘洛尔混合溶液时，随着普萘洛尔浓度的增加，心输出量逐渐减少，收缩程度逐渐减小，心肌舒缩幅度明显变小，显示出其对异丙肾上腺素的拮抗作用。心电图中表现为心率逐渐变慢，PR间期逐渐延长，QRS波群时间逐渐延长，QT间期逐渐变小，进一步证实了其拮抗作用。

通过灌注异丙肾上腺素和普萘洛尔发现有趣的一点:用异丙肾上腺素置换任氏液后，随着异丙肾上腺素浓度的增加，R波和R+S波电压逐渐变大;而在灌注异丙肾上腺素和普萘洛尔混合溶液时，R波和R+S波电压逐渐变小。这种现象与心脏机械性收缩过程中的舒缩幅度的变化趋势相似，见图3、4。心电图是通过放置在体表的电极记录到心脏电活动图形，而心脏收缩由心肌细胞电活动所引发。在一定的初长度下，工作细胞可通过增加粗肌丝上活化的横桥数目来增强心肌收缩力。活化的横桥在全部横桥中所占的比例决定于兴奋时胞质内Ca2+的浓度和(或)肌钙蛋白对Ca2+的亲和力。两栖类的心肌细胞肌质网很不发达［7］，ryanodine受体几乎难以找到［8］，心肌收缩主要依赖细胞外钙内流。异丙肾上腺素可通过cAMP转导途径，激活细胞膜上的L型钙通道，增加Ca2+内流，使心肌收缩力增强。本实验中蟾蜍心尖拉向左后肢标准肢体Ⅱ导联的正极方向，而异丙肾上腺素能够使心脏舒张程度增大，导致心室在舒张期与心电图正极之间的距离变小。由于心电图QRS波群振幅大小与正电极和心室间距离的平方成反比［9］，异丙肾上腺素引起的心室与正极之间的距离变小可能引起QRS振幅变大。具体原因有待进一步证实。

由于本实验方法能够用简单的设备和材料同时监测心脏机械性活动和电活动过程，具有简单、有效而且经济等优点，对于心脏的生理、病理生理和药理学研究，以及医学生在机能实验学的综合性、设计性和探索性实验研究等有一定的参考价值。

［1］徐叔云，卞如濂，陈修，等.药理实验方法学［M］.第3版.北京:人民卫生出版社，2001.986 －987，998.

［2］朱忠宁，任雷鸣，赵丁，等.尿皮素对高血压大鼠离体心肌的正性肌力效应［J］.中国病理生理杂志，2008，24(2):261－265.

［3］林平，潘慧，苏付荣，等.离体蛙心灌流实验方法的比较研究［J］.中国病理生理杂志，2005，21(7):1455 －1456.

［4］宋士军，郭书梅，王福伟.一种同步记录蛙类心脏机械和电活动的方法［J］.河北医科大学学报，2006，27(4):299－300.

［5］McKean T，Scherzer A，Park H.Hypoxia and ischaemia in buffer－ perfused toad hearts［J］.J Exp Biol，1997，200(Pt 19):2575－2581.

［6］郑广华，陈钟伦，蒋家华.O－(4－乙氧基丁基)小檗胺对离体蛙心的影响［J］.中国药理学报，1998，19(5):497－500.

［7］Page SG，Niedergerke R.Structures of physiological interest in the frog heart ventricle［J］.J Cell Sci，1972，11(1):179－203.

［8］Tijskens P，Meissner G，Franzini－ Armstrong C.Location of ryanodine and dihydropyridine receptors in frog myocardium［J］.Biophys J，2003，84(2 Pt 1):1079 －1092.

［9］郭继鸿.心电图学［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，2002.59 －62.