长期甲状腺素刺激对大鼠心肌Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ的影响*

李 超，刘善红，张家明，刘 敏，李景东

(华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科，湖北 武汉 430022)

甲状腺素所致心肌肥厚的动物模型其血流动力学表现为心率加快、心输出量增加、心肌收缩力增强及舒张期缩短，而上述病理生理变化都涉及心肌细胞内Ca2+释放和重吸收平衡的改变。研究表明:甲状腺素通过改变心肌细胞膜上的L型－钙离子通道(L－type Ca2+channels，LTCCs)、肌浆网膜(sarcoplasmic reticulum，SR)上的Ca2+释放通道即兰尼碱受体2(ryanodine receptors，RyR2)、钙 ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+－ATPase 2a，SERCA2a)与受磷蛋白(phospholamban，PLB)等通道蛋白的表达和活性，来影响SR 内 Ca2+释放和重吸收平衡［1］;而 RyR2、SERCA2a、PLB 及LTCCs等上述通道蛋白均受Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin－dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)的直接调节，过度表达CaMKⅡ的小鼠将引起心脏的结构和电重构［2］，提示心肌细胞内CaMKⅡ与心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的发生发展密切相关。作为参与细胞内Ca2+调控的重要信号分子，CaMKⅡ激活是否受甲状腺素的影响，CaMKⅡ是否参与长期甲状腺素刺激诱导的甲亢性心脏病的发生发展，目前国内外缺乏这方面的研究。本研究利用长期甲状腺素刺激致大鼠心肌肥厚模型，观察心肌CaMKⅡ的变化，为探讨CaMKⅡ是否参与长期甲状腺素刺激诱导的甲亢性心脏病的发生发展提供实验依据;进而有可能用CaMKⅡ抑制剂来治疗甲亢性心脏病。

材料和方法

1 材料

1.1 动物模型制备及分组 健康雄性SD大鼠20只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，体重为180～210 g(196.5 g±7.3 g)。将SD大鼠随机分为甲状腺素刺激组和对照组，每组各10只，以0.2 mg·kg－1·d－1的剂量腹腔注射甲状腺素或等体积生理盐水3个月(每次给药前称体重)，均以标准饲料喂养。

1.2 试剂 甲状腺素粉剂、SDS、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、Tris碱(Sigma);大豆胰蛋白酶抑制剂(Amresco);BCA法试剂盒(Pierce);ECL发光试剂盒(Amersham);兔抗GAPDH抗体、山羊抗 CaMKⅡδ(A－17)抗体(Santa Cruz);兔抗CaMKⅡ(Thr286)抗体(Cell Signaling);辣根过氧化物酶标记的相应Ⅱ抗均购自武汉安特捷生物技术有限公司;Trizol、逆转录试剂盒、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物工程有限公司;其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由大连宝生物工程有限公司根据设计合成。

2 方法

2.1 心肌肥厚和纤维化测定 以10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，麻醉成功后仰卧位固定于动物手术台上，沿胸骨左缘开胸迅速取出心脏，用PBS洗净残血、沿室间隔分离左右心室肌后，滤纸吸干后称重并记录心脏各部分重量。取部分左室中段横截面心肌，常规制片后行HE染色，在显微镜下放大400倍拍照，每张切片随机选取10个视野，每个视野选10个心肌细胞测量其横径大小并取其平均值反映心肌肥厚;常规制片后行Masson染色，在显微镜下心肌细胞呈紫红色，胶原纤维呈蓝色，采用Image－Pro Plus 6.0彩色病理图文分析系统在胶原组织Masson三色染色下测量心肌血管周围胶原面积(perivascular collagen area，PVCA)和血管腔面积(vascular luminal area，VA)，以PVCA/VA作为心肌纤维化指标，每一标本取6条壁内小动脉横切面进行测量，取其平均值反映心肌纤维化程度。

2.2 用实时定量RT－PCR法检测心肌组织中CaMKⅡ mRNA的表达 利用Trizol法提取心肌组织中总RNA，然后通过常规反转录－扩增法检测目的基因mRNA的表达。CaMKⅡ上游引物5'－AGAAGTTCAAGGCGACCAGCA －3'，下游引物5'－GGGTATCCCACCAGCAAGATGTAG－3';内参照基因GAPDH上游引物5'－CTATCGGCAATGAGCGGTTC－3'，下游引物5'－CTTAGGAGTTGGGGGTGGCT－3'。用逆转录试剂盒制备cDNA后，取适量的cDNA进行PCR扩增，其反应条件:50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min预变性，95 ℃ 15 s，64 ℃ 15 s，72 ℃45 s，共40个循环，72℃ 10 min。以熔解曲线和产物电泳结果判断反应产物特异性。依据公式 ΔCt=Ct目的基因－Ct内参照基因求得两组ΔCt，根据实时定量PCR原理，待扩增目的基因的Ct值与该基因的拷贝数呈反比，ΔCt值越大表明基因表达量越低，用2－ΔΔCt的方法求得CaMKⅡ mRNA的相对含量。

2.3 心肌组织中CaMKⅡ的表达与活性的检测 取左室游离壁心肌组织100 mg左右剪碎，放入匀浆器中，加入1 mL裂解液(50 mmol/L Tris－HCl pH 7.5，100 mmol/L KCl，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.1 mmol/L PMSF，50 mmol/L NaF，50 mmol/L β －磷酸甘油，20 mmol/L焦磷酸钠，1 mmol/L LR微囊藻素，20 mg/L大豆胰蛋白酶抑制剂，5 mg/L亮肽素)充分匀浆，4℃12000×g离心15 min，取上清分装后置于－70℃保存。BCA法测定蛋白浓度后，每组取适量等量蛋白(约60 μg)加上样缓冲液，PCR仪99℃10 min，使蛋白充分变性。采用9%SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS－PAGE)分离(100 V，120 min)蛋白，硝酸纤维素膜电转印(300 mA，70 min)，丽春红S液染膜，0.3%TBST液洗膜3 min×3次，5%脱脂奶粉封闭3 h后加入山羊抗CaMKⅡδ(A －17)抗体1∶200、兔抗 CaMKⅡ(Thr286)抗体 1∶500、兔抗GAPDH抗体1∶1000于4℃孵育过夜，TBST洗膜15 min×3次后加入相应Ⅱ抗，室温下孵育2 h，TBST洗膜15 min×3次(CaMKⅡ磷酸化蛋白的Ⅰ抗和Ⅱ抗洗膜7 min×3次)，DAB显色，用图像分析系统(Gel－Pro Analyzer 4.0)对蛋白条带进行半定量分析，用平均灰度值代表蛋白表达水平。

3 统计学处理

结 果

1 一般情况观察

甲状腺素刺激组造模3～7 d后大鼠开始出现食欲及活动明显增强、烦躁不安、心率加快、体重增长速度减慢等表现。造模3个月后实验组大鼠体重增加81.5 g±12.3 g，对照组大鼠体重增加248.5 g±14.2 g，差异显著(P＜0.05)。

2 2组心肌肥厚和心肌纤维化程度比较

从图1和图2中可以明显看出实验组大鼠心肌纤维横径比对照组明显增粗，并且左室心肌纤维化程度明显增加。甲状腺素刺激组大鼠的心重、心重/终体重、左心室重/终体重、左室心肌细胞横径及左室心肌纤维化程度(PVCA/VA)分别是正常组的1.17倍、1.87倍、1.84倍、2.15倍和1.94倍，见表1。

Figure 1.The comparison of left ventricular myocardial fiber diameter size(HE staining，× 400).A:control;B:hyperthyroid.图1 左室心肌纤维横径大小的比较

Figure 2.The comparison of left ventricular myocardial fibrosis(Masson staining，× 400).A:control;B:hyperthyroid.图2 左室心肌纤维化程度的比较

3 定时定量RT－PCR结果

甲状腺素刺激组和对照组心肌细胞中CaMKⅡmRNA的相对表达量分别为0.28±0.19和1.60±0.45，甲状腺素刺激组心肌细胞中CaMKⅡmRNA表达量是对照组的40%，差异显著(P ＜0.05)，见图3。

表1 体重、心重及心肌细胞横径与心肌纤维化的变化Table 1.The changes of BW，HW，HW/BW，LVW/BW，myocardial cell diameter and myocardial fibrosis(.n=10)

表1 体重、心重及心肌细胞横径与心肌纤维化的变化Table 1.The changes of BW，HW，HW/BW，LVW/BW，myocardial cell diameter and myocardial fibrosis(.n=10)

*P ＜0.05 ，＊＊P ＜0.01 vs control group.IBW:initial body weight;FBW:final body weight;HW:heart weight;LVW:left ventricular weight;MCD:myocardial cell diameter.

PVCA/VA Control 197.00 ±7.15 445.50 ±19.21 1.16 ±0.11 Group IBW(g) FBW(g) HW(g) HW/FBW(mg/g)LVW/FBW(mg/g) MCD(μm)2.61 ±0.14 1.90 ±0.14 53.76 ±11.00 1.68 ±0.38 Hyperthyroid 196.00 ±7.38 277.50 ±15.32＊＊ 1.36 ±0.11* 4.90 ±0.31* 3.49 ±0.21＊＊ 115.37 ±48.00＊＊ 3.27 ±0.66*

Figure 3.The relative expression level of CaMKⅡ mRNA in the two groups..n=10.*P＜0.05 vs control.图3 2组CaMKⅡmRNA相对表达水平

4 心肌组织中CaMKⅡ蛋白表达与活性的变化

从图4A可看出甲状腺素刺激组与对照组心肌均有CaMKⅡ的表达，实验组的CaMKⅡδ总蛋白的条带较对照组淡和窄，而其磷酸化蛋白的条带较对照组则明显增宽变深;图4B为CaMKⅡδ(A－17)总蛋白和CaMKⅡ(Thr286)磷酸化蛋白表达半定量分析。CaMKⅡδ(A－17)总蛋白:0.35±0.01与0.28±0.05，甲状腺素刺激组CaMKⅡδ总蛋白表达水平仅为对照组的79%;CaMKⅡ(Thr286)磷酸化蛋白:0.26±0.02与0.40±0.03，差异为1.58倍，两者差异显著(P＜0.05)。

Figure 4.The protein expression of CaMK Ⅱδ(A －17)and CaMK Ⅱ(Thr286).1～4:hyperthyroid;5～6:control..n=10.*P＜0.05 vs control.图4 CaMKⅡδ(A－17)和CaMKⅡ(Thr286)的表达

讨 论

本研究发现:长期甲状腺素刺激致心肌肥厚可降低心肌CaMKⅡ的表达，但其CaMKⅡ的活性却增加，说明CaMKⅡ在甲亢性心脏病的发展中的发生了重要改变。甲状腺素是维持机体新陈代谢、生长发育中具有重要作用的内分泌激素，心肌肥厚是甲状腺功能亢进所致心肌损害的严重并发症，其血流动力学表现为心率加快、心输出量增加、心肌收缩力增强及舒张期缩短［3］。在慢性甲状腺素刺激诱导甲亢性心脏病时，甲状腺素通过何种途径参与心肌损害的发生发展，其具体发生机制仍不太明确。目前研究认为以下途径可能参与甲亢性心脏病的发生发展:(1)甲状腺素通过甲状腺素受体(thyroid hormone receptors，TRs)结合到细胞染色体上，调控靶基因的调节区域，从而影响其相应靶基因的表达(即经典基因调控机制)，如甲状腺素诱导β－肌球蛋白重链(β－myosin heavy chain，β－MHC)向 α－肌球蛋白重链(α－myosin heavy chain，α－MHC)亚型的转换、增加 SR膜上 RyR2和SERCA2a的表达、降低PLB的表达及上调β－肾上腺素受体(β －adrenergic receptor，β － AR)等［1］;(2)细胞信号转导通路(即非基因调控机制)，如甲状腺素可激活 MAPK、mTOR/AKT、ERK等信号转导通路，促使心肌细胞及心肌纤维增殖肥大，并且抗细胞增殖药物雷帕霉素可抑制甲状腺素所致心肌肥厚［4－6］;同时也有研究表明:长期甲状腺素刺激的大鼠可增加其血液和组织中的肾素和血管紧张素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)水平以及激活机体交感肾上腺系统，但甲状腺素使心肌组织中肾素和AngⅡ水平升高不依赖β－AR激活以及血液中肾素－血管紧张素－醛固酮系统(renin－angiotensinaldosterone system，RAAS)的激活，交感神经拮抗剂或双肾切除术都无法阻止甲状腺素所致心肌肥厚［7］，提示有其它信号机制参与甲亢性心脏病发生发展。

CaMKⅡ是Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶的成员之一，目前研究发现CaMKⅡ在心脏中有细胞核型CaMKⅡδB和胞浆型CaMKⅡδC两种不同的剪接体，前者主要参与基因的表达调控，而后者主要参与Ca2+依赖的信号转导途径［8］。过度表达CaMKⅡδC小鼠会引起心腔明显扩大、心肌功能障碍、细胞内Ca2+稳态失衡及猝死［8］;而过度表达CaMKⅡδB的心肌细胞有明显的肥大，而抑制CaMKⅡ活性及表达可减轻心肌肥大、改善心功能及降低恶性心律失常甚至猝死的发生［8－9］;大量研究表明慢性转基因抑制 CaMKⅡ或CaMKⅡ抑制剂KN－93均可减轻心肌对慢性β－AR刺激的反应［10］。提示心肌细胞内CaMKⅡ在心肌肥厚、心律失常和心力衰竭的发生发展中起着重要的信号转导作用［11］。CaMKⅡ的激活包括钙调蛋白(calmodulin，CaM)依赖性激活和非CaM依赖性的氧化激活。前者与β－AR和α－AR信号系统激活密切相关，机体交感肾上腺系统激活导致胞浆内Ca2+浓度(［Ca2+］i)增加，当［Ca2+］i水平升高时，Ca2+与 CaM 结合，后者结合到CaMKⅡ的调节域，改变激酶的构象，激活CaMKⅡ;而当［Ca2+］i降低时，CaMKⅡ自身抑制区和催化域相结合，阻止底物和Mg2+/ATP结合到酶的催化中心，使其激酶处于自身抑制的无活性状态［10，12］。非CaM依赖性的氧化激活途径与CaMKⅡ调节域内甲硫氨酸残基Met281/282的氧化有关，Met281/282的氧化可以阻止催化域与调节域的抑制性结合，引起激酶构象改变，从而激活CaMKⅡ［13］。研究发现，用H2O2处理的Jurkat细胞在没有Ca2+的情况下可通过活性氧介导机制激活CaMKⅡ［14］。

甲状腺素如何影响心肌细胞内CaMKⅡ的表达和活性，其具体发生机制尚无定论，但相关研究提示两者之间相互影响。Jiang等［15］研究表明短期(7 d)甲状腺素降低兔心肌CaMKⅡ的表达和活性，值得提出的是:该模型并没有提到造成了兔心肌肥大;另外，大剂量短期(14 d)甲状腺素(1 mg·kg－1·d－1)皮下注射也未导致狗心肌肥大［16］;因而对甲亢性心脏病时CaMKⅡ表达和活性的改变尚不清楚的。甲状腺素增加心肌SR膜上SERCA2a和RyR2通道的表达和活性，同时降低心肌SR膜上PLB的表达及活性，减少PLB对SERCA2a的抑制效应，上述效应将明显提高SR内Ca2+转运速度，导致单位时间内Ca2+在胞浆内滞留间期缩短，引起CaMKⅡ的CaM依赖性激活能力下降［1］，从生理意义上讲，心肌内CaMKⅡ表达下降是机体平衡甲状腺素使SR内Ca2+转运能力增强的一种生理性适应;同时也有研究表明:甲状腺素诱导兔骨骼肌的β－MHC向α－MHC的转换过程中，其肌纤维中CaMKⅡ全酶的构成亚基及含量存在着差异并可能与CaMKⅡ表达及活性下降有关［17－18］。我们的研究发现:在慢性甲状腺素刺激诱导心肌肥厚模型中，甲状腺素降低心肌CaMKⅡ的表达，但其CaMKⅡ的活性却增加，但其具体机制仍需要进一步研究证实。其原因可能与下面因素有关:(1)长期甲状腺素刺激可增加大鼠血液和心肌组织中的肾素和AngⅡ水平［7］，导致其心肌 CaMKⅡ的活性升高;(2)长期甲状腺素刺激引起机体交感肾上腺系统过度亢进，蛋白激酶A(protein kinases A，PKA)过磷酸化可使活性状态下的RyR与FK506结合蛋白12.6(FK506 bindingproteins 12.6，FKBP12.6)解离，同时上调心肌SR膜上PLB的表达，增加PLB对SERCA2a的抑制效应［19］，降低SR内Ca2+转运速度，当上述效应强于甲状腺素使SR内Ca2+转运能力增强时，将导致心肌舒张期胞浆内［Ca2+］i升高，从而引起CaMKⅡ激活;(3)长期甲状腺素刺激引起心肌无氧代谢增强，心肌存在过度氧化应激可能使CaMKⅡ的非CaM依赖性的氧化激活途径增强。由于活性增加的CaMKⅡ可导致心肌肥大［9］，我们的研究提示:在慢性甲状腺素刺激诱导甲亢性心脏病时，可以考虑应用CaMKⅡ抑制剂来抑制心肌肥厚和心肌纤维化。

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