转染isl1基因促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化*

李杏肖，李晓红，林秋雄，肖定璋，刘晓颖，单志新，朱杰宁，麦丽萍，夏慧苏，余细勇

(广东省心血管病研究所，广东省人民医院，广东省医学科学院，广东 广州 510080)

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)有较高的端粒酶活性［1］，具有自我更新和多向分化潜能。在一定环境下可转变生成心肌细胞，移植时不会引起免疫排斥反应［2］，对人体来讲是相对安全的［3］。因此，探索用BMSCs修复损伤的心肌组织，重建新生血管，为缺血性心脏病治疗带来新的希望。体外实验证明，在心脏发生和多能心脏祖细胞分化为心肌细胞系、内皮细胞系和平滑肌细胞系的过程中，LIM(Lin－11、Isl－1和Mec－3)同源结构域转录因子Islet 1(insulin transcription factor 1，Isl1)发挥着十分重要的作用［4－6］。Moretti等［7］进一步的研究发现，Isl1+心脏祖细胞可分化为心肌细胞。

将未分化的骨髓间充质干细胞直接移植入体内，其将自主分化为多种细胞类型，并可形成畸形瘤。为了避免畸形瘤的形成，在移植前，干细胞必须分化为特定的细胞系。另外，目前研究表明，单一条件下，骨髓间充质干细胞成肌分化率并不高。因此，本研究采用微环境和转录因子Isl1联合应用的策略观察骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的能力，为基因治疗提供进一步的理论基础和实践依据。

材料和方法

1 主要试剂

人骨髓间充质干细胞生长完全培养基购于Cyagen，按说明书配制，4℃ 保存;DMEM/F12培养基购于HyClone;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于Gibco。Polybrene和 puromycin购于 Sigma;Standard Transwell Insert购于 Corning。新生 SD乳鼠(1～3 d)购自广州市白云区龙归岭南科研动物养殖场。Trizol购于Molecular Research Center;GoTap® Green Master Mix购于 Promega;PrimeScriptTMRT Reagen Kit及SYBR® Premix Ex TaqTM购于 TaKaRa。GAPDH(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，磷酸甘油醛脱氢酶)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)、心肌肌钙蛋白 I(cardiac troponin I，cT-nI)、α－辅肌动蛋白(α－actinin)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的Ⅱ抗均购于Sant Cruz;FITC(fluorescein isocyanate，异氰酸荧光素)标记Ⅱ抗购于Invitrogen;Isl1蛋白抗体购于Proteintech Group;二脒基苯基吲哚(4，6－diamidino－2－ phenylindole，DAPI)购于 Sigma。

2 方法

2.1 骨髓间充质干细胞的分离和培养 本实验采用骨穿法获取人体骨髓，联合应用差速贴壁法和密度梯度离心法分离获得BMSCs。样本置于人BMSCs生长完全培养基(Cyagen)中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。72 h后更换培养液，弃去未贴壁细胞，此时贴壁细胞即为BMSCs。当细胞达80%融合时即可进行传代。

2.2 稳定细胞株BMSC－isl1的制备及鉴定 本实验采用慢病毒LVS－isl1(广州赛业生物科技有限公司制备)感染 BMSCs。感染时，加入8 mg/L polybrene。感染后第2 d，换液(不含 polybrene)。感染后第3 d，开始稳定细胞株的筛选(0.5 mg/L puromycin)，10～12 d后即可形成抗puromycin的稳定表达Isl1的细胞株，命名为BMSC－isl1。携带EGFP但不携带Isl1的慢病毒感染BMSCs，筛选获得的稳定表达细胞株，命名为BMSC－vehicle。

获得稳定表达的细胞株后，RT－PCR检测BMSC－isl1中Isl1 mRMA的表达水平;Western blotting检测BMSC－isl1中Isl1蛋白表达水平。

引物序列:Isl1正义链 5'－GCTCGTCGTCGACAACGGCTC－3'，反义链 5'－CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC－3';β－actin正义链5'－GCGAATGTTTCCGCTGTGTAG －3'，反义链 5'－AGCTTACAAAGGCGACACATC －3'。

2.3 乳鼠心肌细胞的分离、培养 新生1～3 d SD乳鼠，取出心脏，加入0.25%胰酶反复消化至组织块消化完全，2500 r/min离心10 min，去上清。用培养基将沉淀的细胞重悬并转入至培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱中培养。2 h后显微镜观察并计数，将未贴壁细胞转入Transwell小室(直径为0.4 μm)中培养。

2.4 模拟心肌微环境的非接触共培养 BMSCs和乳鼠心肌原代细胞用Transwell小室以1:10的比例共培养，下层分别种植BMSCs、BMSC－vehicle或者BMSC－isl1，上层种植乳鼠心肌原代细胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃培养箱，隔天换液。

2.5 Isl1的调控能力考察 共培养1周结束后，观察BMSCs分化为心肌样细胞的能力，并在mRNA水平和蛋白水平进行检测。(1)Real－timePCR检测心脏特异性转录因子GATA结合蛋白4(GATA－binding protein 4，GATA4)、NK2 转录因子 5(NK2 transcription factor related，locus 5，NKx2.5)和肌细胞增强因子 2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)，以及心肌特性基因兰尼碱受体2(ryanodine receptor 2，RyR2)mRNA表达水平;(2)Western blotting检测心肌特异性蛋白cTnT的表达;(3)免疫荧光检测心肌特异性蛋白α－actinin和cTnI的表达。

引物序列:GATA4正义链 5'－GCTGGAGCTCAAGGAGACTC －3'，反义链 5'－TACTGATTTTCCAGCCATTTCA－3';Nkx2.5正义链 5'－GCTCCCAACATGACCCTGAG－3'，反义链 5'－ TGCCCATGGACTCTCGGAG－3';MEF2C正义链5'－ATATCATTGGCGTATGGCAC －3'，反义链 5'－ AAAAAGCCACAAATGCTTTG－3';RyR2正义链 5'－TACCAG-CAAGCCCGACTC －3'，反义链 5'－ACCTTGAGAGCAACGAGGAA－3';β－actin正义链5'－GCCAACACAGTGCTGTCTG －3'，反义链 5'－TACTCCTGCTTGCTGATCCA －3'。

3 统计学处理

结 果

1 稳定细胞株BMSC－isl1的鉴定

慢病毒感染BMSCs后，从mRNA水平和蛋白水平两个层面对细胞进行了鉴定。RT－PCR和Western blotting结果均显示，BMSCs、BMSC－vehicle中无Isl1的表达，BMSC－isl1组Isl1有较高表达，见图1。表明已成功获得过表达Isl1的稳定细胞株BMSC－isl1。

Figure 1.Identification of stable BMSC －isl1 cell line.Representative RT－PCR(A)and Western blotting assays(B)of Isl1 are shown.BMSCs were maintained in human MSC complete medium and transfected with LVS－isl1 when cells reached 70%confluence.After 48 h，BMSCs were treated with puromycin(2 mg/L).After 7～10 d treatment of puromycin，cells were harvested and total RNA and cell lysates were subject to RT － PCR and Western blotting assays，respectively.图1 BMSC－isl1中Isl1 mRNA及蛋白的表达

2 共培养1周后检测Isl1的调控能力

Real－time PCR检测结果显示(图2)，BMSCs组和BMSC－vehicle组相比，心肌特异性转录因子GATA4、Nkx2.5和MEF2C，以及心肌特异蛋白RyR2 mRNA表达差异无统计学意义(均P＞0.05)。BMSC－isl1组心肌特异性转录因子GATA4、Nkx2.5和MEF2C，以及心肌特异蛋白RyR2 mRNA的表达较之BMSCs组和BMSC－vehicle组均有提高，且差异有统计学意义(均P＜0.05)。

Figure 2.Effects of Isl1 on BMSC differentiation tested by examining the mRNA expression of GATA4，Nkx2.5，MEF2C and RyR2.BMSCs，BMSC－vehicle and BMSC－isl1 stable cell line were co－cultured with neonatal rat ventricular myocytes for 1 week.The cells were collected and total RNA was subject to real－time PCR analysis..n=3.*P＜0.05 vs BMSCs or BMSC －vehicle.图2 微环境中Isl1对BMSCs分化能力的影响

Western blotting检测结果显示(图3)，BMSCs组和BMSC－vehicle组相比，cTnT的表达差异无统计学意义(P＞0.05)，BMSC－isl1组与 BMSCs组及BMSC－vehicle组相比，cTnT的表达增加，且差异有统计学意义(均 P ＜0.05)。

Figure 3.Effects of Isl1 on BMSC differentiation tested by examining the expression of cTnT.BMSCs，BMSC －vehicle and BMSC－isl1 stable cell line were co－cultured with neonatal rat ventricular myocytes for 1 week.The cells were harvested and cell lysates were subject to Western blotting assay..n=3.*P＜0.05 vs BMSCs or BMSC －vehicle.图3 微环境中Isl1对BMSCs cTnT表达的影响

免疫荧光结果显示(图4)，BMSCs组和BMSC－vehicle组内BMSCs有少量 α－actinin和cTnI的表达，而且2组表达量相近。BMSC－isl1组内心肌特异性蛋白α－actinin和cTnI的表达量比BMSCs组及BMSC－vehicle组有显著提高。

Figure 4.Immunostaining of α －actinin and cTnI in BMSCs，BMSC －vehicle and BMSC －isl1 stable cell line(×400).BMSCs，BMSC－vehicle and BMSC－isl1 stable cell line were seeded on coverslip and co－cultured with neonatal rat ventricular myocytes for 1 week，then the cells were fixed and stained.图4 微环境中 Isl1对BMSCs α－actinin和cTnI表达的影响

讨 论

尽管BMSCs的研究较多，但多为现象的观察，其诱导分化为心肌细胞的调控机制知之甚少，甚至完全不了解，以致于目前所有的方法均诱导效率偏低，存活时间短，无法真正满足临床治疗的需要。

无论是在胚胎期心脏发生，还是在干细胞向心肌分化过程中，Nkx2.5和 GATA4的表达是必需的［8］。GATA4是心脏前体细胞的最早期标志之一，是心脏发育过程中的重要转录因子［9］。Nkx2.5具有显著的心脏特异性表达的特点，对心肌细胞的分化起到重要作用［10］。Nkx2.5的激活常常意味着心肌分化程序的启动［11］。MEF2C被称为心肌增强因子，含有2个LIM同源结构域蛋白IslI结合位点，进一步研究表明，在小鼠胚胎发育的心脏前期发生过程中，MEF2C是IslI的直接下游靶基因［12］。无独有偶，微环境诱导下，BMSC－isl1向心肌样细胞分化过程中，我们也观察到MEF2C基因表达的升高。

微环境诱导下，BMSC－isl1组 GATA4、Nkx2.5和MEF2C等心脏转录因子的基因表达有明显的增加，提示心肌分化程序已经启动，且表明BMSC－isl1向心肌方向分化的能力高于BMSCs和BMSC－vehicle组。

RyR2是主要在心肌细胞肌质网上表达的Ca2+释放通道，大多数RyR2分布在肌质网的膜区［13］。肌钙蛋白是肌肉收缩的调节蛋白，具有高度的心肌特异性。心肌肌钙蛋白(cardiac troponin，cTn)由3种不同基因的亚基组成:cTnT、cTnI和cTnC。在心肌细胞收缩和舒张过程中发挥重要作用［14］。α－actinin是区分肌细胞和非肌细胞弹力纤维的标志。α－actinin的表达密度随着心肌细胞的成熟同步增多［15］。

实验中共培养环境下，BMSCs、BMSC－vehicle和BMSC－isl13组细胞中检测到心肌特异性蛋白RyR2、cTnT、cTnI以及 α －actinin的表达，结果和同类文献报道相同［11］，说明3组细胞均向心肌样细胞分化。其中，BMSCs组和BMSC－vehicle组各mRNSA和蛋白的表达量相当，说明慢病毒对BMSCs的分化能力没有影响。BMSC－isl1组较其它2组mRNA和蛋白的表达均明显提高，即BMSC－isl1的心肌分化能力要高于另外2组，提示Isl1对BMSCs向心肌样细胞分化起促进作用。

综上所述，本研究发现，在乳鼠心肌原代细胞共培养的微环境中，Isl1具有提高BMSCs向心肌细胞分化的能力。这一结果为提高干细胞定向分化效率探索了新的途径，亦使干细胞治疗走向临床又向前迈进了一步。

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