戊四唑致痫大鼠脑内缝隙连接的作用*

赵秀鹤，曹丽丽，王胜军，张同霞，刘学伍，迟兆富

(山东大学齐鲁医院神经内科，山东 济南 250012)

细胞间直接的电紧张性连接，即缝隙连接(gap junction，GJ)，是细胞间直接交换物质和信息的结构基础，在细胞生长发育、多细胞器官间的协调及机体自我稳定控制方面有重要作用［1-2］。近年来的研究表明，由缝隙连接形成的电突触在脑内形成一种交通环路，控制和维持局部的兴奋性活动，在癫痫同步化发病机制中起着重要作用，与化学性突触可能是其中共同存在的两种突触传递机制［1-4］。本文以戊四唑(pentylenetetrazol，PTZ)诱发的大鼠癫痫模型为对象，研究缝隙连接蛋白(connexin，Cx)32和Cx43在神经元的表达，并分别加用抗癫痫药卡马西平(carbamazepine，CBZ)和GJ解偶联剂甘珀酸(carbenoxolone，CBX)进行干预，观察其对癫痫发作和Cx32/Cx43表达的影响，试图探究GJ在癫痫发病中的作用及其机制。

材料和方法

1 材料

1.1 实验对象 成年雄性Wistar大鼠，由山东大学实验动物中心提供。

1.2 主要试剂 CBX、CBZ和PTZ均为Sigma产品;兔抗鼠Cx32和Cx43多克隆抗体为晶美生物工程有限公司产品;SYBR RT-PCR Kit(Perfect Real Time)为TaKaRa大连宝生物工程有限公司产品。

1.3 主要仪器设备 实时定量PCR扩增仪(Light Cycler 2.0)为Roche产品;PCR扩增仪(Tgradient48)为Biometra产品;数字凝胶成像系统(Flurochem 9900-50)为 Alpha Innotech产品;恒冷切片机(CM1900)为Leica产品。

2 方法

2.1 动物分组和模型的建立 成年雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，随机分为PTZ组、CBX干预组(PTZ+CBX组)、CBZ干预组(PTZ+CBZ组)和生理盐水对照组(NS组)4组。PTZ组腹腔注射PTZ 50 mg/kg，0.5 h后再半量注射1次，从出现Racine分级标准［5］Ⅲ级发作开始计时，分别在 2 h、5 h、8 h、10 h和24 h处死动物。PTZ+CBX组预先腹腔注射CBX 300 mg/kg，0.5 h后按上述方法加注PTZ;PTZ+CBZ组预先腹腔注射CBZ 40 mg/kg，余处理同上;NS组用等量NS代替PTZ注射，余处理同上。实验结束时每组动物分别为PTZ组26只，PTZ+CBX组28只，PTZ+CBZ组23只和NS组6只。根据Racine癫痫大鼠分级标准判断动物发作分级［5］:0级，正常行为状态;I级，面肌抽动;Ⅱ级，节律性点头;Ⅲ级，单侧前肢阵挛;IV级，双前肢阵挛伴站立;V级，持续站立，失去平衡、跌倒。

2.2 免疫组织化学法检测Cx32和Cx43

2.2.1 组织切片制备 大鼠经10%水合氯醛(300 mg/kg，腹腔注射)过量麻醉，按常规方法取脑、固定、OCT包埋、快速冰冻、连续切片，切片厚度为20 μm，裱于铬钒明胶包被的清洁载玻片上，-20℃保存备用。

2.2.2 免疫组织化学染色(S-P法) 按照试剂盒说明书进行，I抗为兔抗Cx32或Cx43抗体。免疫组织化学染色结果的判断标准及方法:以胞浆或胞核染成棕黄色为阳性。在高倍显微镜下随机选取视野，计数大鼠皮层和海马齿状回、Ammon角(cornu ammonis)CA1区和CA3区100个细胞中的阳性细胞个数，重复5次，取其均值作为阳性百分率。

2.3 荧光实时定量RT-PCR法分析Cx32和Cx43的表达

2.3.1 大鼠海马标本的收集 大鼠经断头取脑，快速分离出双侧海马，置于-80℃冰箱内保存待用。

2.3.2 引物设计 Cx32、Cx43和β-actin的PCR扩增引物序列由上海Invitrogen公司设计合成。Cx32上游引物5'-TGT AAC AGC GTC TGC TAT GAC-3'，下游引物 5'-GCG AGC ATA AAG ACA GTG AA-3'，扩增片段为409 bp;Cx43上游引物5'-CTT CAT GCT GGT GGT GTC C-3'，下游引物 5'-TGG CAT TCT GGT TGT CGT C-3'，扩增片段为400 bp;β-actin上游引物5'-AAG ATC CTG ACC GAG CGT GG-3'，下游引物 5'-CAG CAC TGT GTT GGC ATA GAG G-3'，扩增片段为 327 bp。

2.3.3 总RNA的提取 按照硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法提取总RNA。

2.3.4 逆转录(RT)反应 按照试剂盒使用说明配成 RT 反应体系如下:oligo dT(50 μmol/L)0.5 μL，5 × M-MLV buffer 2 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，M-MLV RT(2 ×108U/L)0.25 μL，RNase inhibitor(4 × 107U/L)0.25 μL，RNA 5 μL，RNase-free dH2O 1.5 μL，总体积 10 μL。将以上反应体系于 42℃ 15 min、95℃ 2 min进行cDNA合成反应。

2.3.5 PCR反应 以下各组反应体系依次放入Light Cycler PCR仪中进行real-time PCR反应。Cx32/43 反应体系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Primer 11.2 μL，Primer 22 μL，cDNA 2 μL，dH2O 5.6 μL，总体积20 μL。PCR反应参数:预变性95℃ 10 s，55 ℃ 10 s、72 ℃ 16 s，共40个循环。65℃ 15 s、95℃ 0.1℃/s、40℃ 30 s进行融解曲线分析。βactin 反应体系:SYBR Premix Ex Taq 10 μL，Primer 10.8 μL，Primer 20.8 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6.4 μL，总体积20 μL。PCR反应参数:预变性95℃ 10 s，然后60℃ 10 s退火、72℃ 15 s延伸，共40个循环。最后65℃ 15 s、95℃ 0.1℃/s、40℃ 15 s进行融解曲线分析。

2.3.6 琼脂糖凝胶电泳 取目的基因以及β-actin扩增产物各15 μL，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测目的基因的完整性。

2.3.7 结果分析 结果以目的基因与内参照βactin的比值表示。Cx32(或Cx43)/β-actin比值代表待测样本的Cx32(或Cx43)相对表达。cDNA样本重复2～3管。

3 统计学处理

结 果

1 动物模型行为学观察

PTZ组动物在注射PTZ后93%在2 min内开始发作，迅速进展为IV级发作，80%动物出现V级发作。每次抽搐持续1～10 min不等，常反复发作。90 min后，除个别动物出现短暂发作外，大部分动物停止发作。NS组大鼠均无癫痫发作表现。CBX+PTZ组动物发作强度显著降低，仅个别动物(10%)出现I级兴奋表现，同时发作潜伏期明显延长(平均9 min，P＜0.05)。CBZ+PTZ组2只大鼠出现I级发作，1只出现Ⅱ级发作。

2 免疫组织化学染色结果

PTZ组大鼠皮层和海马在致痫2 h后Cx32阳性细胞开始增多(P＜0.05)，8 h后增多更为明显(P＜0.05)，24 h后表达降至正常水平(P＞0.05)。Cx43阳性神经元同样在致痫2 h开始增多(P＜0.05)，8 h时达NS组的2倍(P＜0.05)，至发作24 h后表达同样显著下降。CBX显著抑制了Cx32和Cx43的表达(P＜0.05)。CBZ对皮层和海马神经元的Cx32和Cx43表达均无明显影响(P＞0.05)，除24 h时点外，余各时点仍显著高于NS组和CBX+PTZ组(P＜0.05)，见图1 和表 1、2。

Fi11gure 1.Expression of Cx32 and Cx43 in the brain of rats(×100).图1 Cx32和Cx43在大鼠脑内的表达

表1 大鼠皮层和海马Cx32蛋白的表达Table 1.Expression of Cx32 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

表1 大鼠皮层和海马Cx32蛋白的表达Table 1.Expression of Cx32 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.

Cortex Hippocampus 2 h 8 h 24 h 2 h 8 h 24 h PTZ 29.50±4.04# 50.83±3.49# 21.08±4.51 33.50±3.94# 57.83±3.54#Group 27.66±4.55 CBX+PTZ 16.83±2.71* 22.33±3.20#* 18.42±4.49 22.67±3.01* 35.50±2.74#* 24.21±3.82 CBZ+PTZ 27.17±3.87#△ 47.67±3.33#△ 21.62±5.01 32.00±3.58#△ 54.17±3.31#△ 28.04±5.23 NS 18.00±2.76 17.36±2.37 19.31±3.71 25.17±3.31 23.83±2.32 25.67±4.36

表2 大鼠皮层和海马Cx43蛋白的表达Table 2.Expression of Cx43 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

表2 大鼠皮层和海马Cx43蛋白的表达Table 2.Expression of Cx43 protein in the cortex and hippocampus of rats(.n=6)

#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.

Hippocampus 2 h 8 h 24 h 2 h 8 h 24 h PTZ 20.83±2.48# 38.17±2.64# 18.34±1.68 24.67±3.50# 39.50±3.27#Group Cortex 19.18±3.25 CBX+PTZ 15.67±2.34* 26.67±3.88#* 16.46±2.17 21.17±2.79 24.83±3.76#* 18.58±4.07 CBZ+PTZ 22.17±2.93#△ 36.67±3.01#△ 20.45±3.08 25.50±3.44#△ 36.33±3.14#△ 20.16±4.24 NS 16.50±2.74 17.50±3.27 17.91±2.83 20.50±2.73 19.33±3.14 18.93±2.88

3 实时定量RT－PCR结果

致痫2 h海马Cx32 mRNA与NS组相比即迅速升高(P＜0.05)，一直持续至8 h仍显著高于NS组水平(P＜0.05)，10 h后始明显降低，接近NS组水平(P＞0.05)。加CBX干预后2～5 h组Cx32 mRNA水平显著降低，但仍高于NS组(P＜0.05)，而8 h和10 h时点接近NS组水平(P＞0.05)。CBZ+PTZ组Cx32 mRNA除10 h组外，余均显著高于CBX+PTZ组和NS组(P＜0.05)，和PTZ组之间无显著差异(P＞0.05)。PTZ组Cx43 mRNA表达水平较低，2 h至5 h表达显著高于NS组(P＜0.05)，至8 h时即降低至NS组水平(P＞0.05)。CBX同样能够抑制其表达，各时点均接近NS组水平(P＞0.05)，在2 h和5 h时与PTZ组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。CBZ干预对Cx43 mRNA表达无明显抑制作用，见图 2、3。

讨 论

近年研究认为，细胞间的联系仍以化学性突触为主，但是“非突触”机制如GJ、场效应和离子的相互作用等在神经元的同步化和癫痫的发病机制中可能具有重要地位。GJ在哺乳动物脑内是一种独立于传统化学性突触的“非突触”细胞间信号转导机制，惊厥的发生不但依赖于兴奋性化学突触传递过程增强，而且也可能与神经元之间由缝隙连接形成的电突触数目增加有关［1，6-7］。

Figure 2.Expression of Cx32 mRNA in the hippocampus of rats..n=6.#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.图2 大鼠海马Cx32 mRNA的表达

Figure 3.Expression of Cx43 mRNA in the hippocampus of rats..n=6.#P＜0.05 vs NS group;*P＜0.05 vs PTZ group;△P＜0.05 vs CBX+PTZ group.图3 大鼠海马Cx43 mRNA的表达

电突触能够促进离子通讯和双向电流的特性使之易于在耦联细胞间形成同步化放电。近几年，许多离体和在体实验证明，缝隙连接的存在是癫痫发生和发展的内在机制之一，我们曾在无镁细胞癫痫模型中研究 GJ的作用［6，8］。本实验结果显示，PTZ致痫2 h后大鼠皮层和海马Cx32 mRNA和蛋白水平即迅速升高。Cx32主要分布在神经元上，参与神经元的电活动、神经元的发育及传递第二信使和一些必需代谢产物［9］。癫痫发作时机体为了适应这种反复过度的电活动环境，其早期表现为加强Cx的合成和利用，以便于维持高频脑电环境下神经元自身的基本功能，因而早期Cx32的表达有所增强，但随着癫痫的这种高频脑电活动的持续发生，大量兴奋性氨基酸的释放、钙超载、氧和葡萄糖相对供应不足，脑内ATP储存减少，造成钠泵功能抑制，进一步加重脑损害，致使神经细胞数量明显减少，因而Cx32表达随之减少。上述结果表明，由Cx32组成的神经元上GJ蛋白在癫痫的始动和发生上有一定作用。

Cx43是星形胶质细胞间电突触的主要缝隙连接蛋白［10-11］，本实验表明神经元表达 Cx43远低于Cx32，但是其mRNA和蛋白表达在癫痫样放电后同样明显增多。Nakase等［12］和 Yoon 等［13］认为广泛的缝隙连接使星形胶质细胞成为一个功能合胞体，星形胶质细胞兴奋引发的Ca2+内流信号会在这个功能合胞体中环行播散开来，称为钙波，对神经调节具有重要意义。因此Cx43很可能与致痫后脑组织结构重塑有密切关联。

GJ阻断剂CBX能够直接和Cx分子结合，引起通道蛋白构象的改变，致通道关闭，不会影响神经元的内在特性［14］。本研究显示CBX不仅能够抑制痫性发作，而且Cx32在基因和蛋白水平均显著受抑。Cx43 mRNA除2 h时点外，其它时点的表达被CBX显著抑制，在蛋白水平可能由于表达较低，接近对照组水平，故加用CBX无明显作用。进一步证实，神经元之间GJ形成的电突触在癫痫的形成过程中具有重要作用。神经元GJ参与癫痫发病的可能机制:(1)GJ允许细胞间直接交换离子，使神经元活动快速同步化，癫痫敏感性增强;(2)GJ是神经元电突触结构基础，在某些病理情况下，可能使电突触数目增加和电传导性增强，导致电突触偶联的神经元数目增加，有利于神经元高度同步化放电，从而增加了癫痫产生的可能性;(3)参与第二信使(Ca2+、cAMP、IP3等)和兴奋性氨基酸、自由基等代谢产物传递;(4)在某些病理条件下，神经元与星形胶质细胞间GJ数目增多和偶联增加，使信息交流加强而引起星形胶质细胞和远隔的神经元异常兴奋［1］。近来有学者发现，CBX通过抑制活化小胶质细胞谷氨酸的释放，降低了缺血所致海马神经元死亡而发挥神经保护作用［15］。

缝隙连接可能具有独立于传统化学性突触的致痫机制。在无钙模型的同步化放电机制中，GJ参与放电持续时间和波幅的调节，而无需化学性突触的存在［16］。而 Todd 等［17］提出，在发育过程中，电突触先于化学性突触形成，可能作为前体促进其发育。2型代谢性谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)活化后，可以上调GJ偶联的发育以及Cx36的表达，抑制γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)A 受体有同样作用［18］，提示化学性突触对电突触的调节作用。Wang等［19］认为，GJ可能参与NMDA受体依赖的兴奋性细胞死亡调节。本研究也发现，传统的抗癫痫药物CBZ仅抑制了PTZ致痫大鼠的痫样发作，而不影响缝隙连接蛋白Cx32和Cx43的表达。可见，对化学性突触和电突触的关系仍需进一步深入研究。

一直以来，抗癫痫药物治疗均以对离子通道以及抑制性氨基酸(如GABA)和兴奋性氨基酸(如谷氨酸)的调节为目标，迄今为止，没有任何抗癫痫药物以GJ为治疗靶点，实验中所用的GJ阻断剂对不同的缝隙连接蛋白没有选择性。不同的GJ是否与不同的发作类型有关，解决这一问题更需要特异性的阻断剂。可见在传统的以化学性突触、离子通道等为作用靶点的抗癫痫药物外，开发作用于缝隙连接通道的治疗药物应是一个有希望的研究方向。

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