免疫复合物致痛与甲醛致痛大鼠疼痛行为的比较*

吴 锐，胡文娟，李荣亨

(1南昌大学第一附属医院中西医结合科，江西 南昌 330006;2重庆医科大学第一附属医院，重庆 400042)

免疫性疾病中常有一部分患者出现疼痛症状，往往随着病情的缓解而缓解，对激素、静脉用丙种球蛋白的反应较镇痛药物更好［1］，因疼痛的发生与自身抗体及免疫复合物的形成有关，故称之为“免疫相关性疼痛”。通常认为这种疼痛是由于免疫复合物激活补体及免疫细胞、释放促炎介质导致，与其它炎症性疼痛相似［2］。但临床中此类患者的疼痛部位并无明显炎症反应。最近有证据表明免疫复合物可直接激活神经元细胞上的Fcγ受体I(Fc－gamma receptor I，FcγRI)而诱发疼痛及痛觉过敏，不需激活炎症反应致痛［3］。因此我们尝试采用纯化的IgG型特异性抗原抗体复合物建立免疫复合物致痛大鼠模型，并与甲醛致炎性痛大鼠模型比较，观察大鼠疼痛行为、局部炎症反应及p38 MAPK在脊髓表达的改变，探讨免疫复合物所致疼痛是否具有不同于普通炎性介质致痛的疼痛特点及机制。

材料和方法

1 动物及分组

30只清洁级健康成年雄性Sprague－Dawley大鼠来源于南昌大学医学院实验动物科学部(动物许可证号:江西医动证字第02196－02)，体重250 g左右。随机分为对照组、免疫复合物组及甲醛组，每组10只。按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

2 主要仪器设备及试剂

正常小鼠IgG(Santa Cruz);纯化大鼠抗小鼠抗体 (Jackson ImmunoResearch);Zeba脱盐离心柱(Thermo Scientific)，抗p38 MAPK及抗磷酸化 p38 MAPK抗体(Cell Signaling);p38 MAPK抑制剂SB203580(Sigma);电泳槽、测试台、von Frey机械痛刺激器等。

3 IgG免疫复合物制备［3］

抗原为正常小鼠IgG，抗体为纯化的抗小鼠IgG的大鼠抗体。为防止叠氮化钠的非特异性反应，抗原及抗体均采用PBS缓冲液(0.01 mol/L)脱洗纯化。抗原及抗体以10 mg/L浓度以1∶1比例在常温下反应1 h，并稀释至1 mg/L。

4 实验过程

甲醛组、免疫复合物和对照组采用右后足底分别皮内注射5%甲醛溶液、制备的IgG免疫复合物和PBS 缓冲液各20 μL。注射前及注射后1 h、2 h、4 h、8 h和12 h分别观察大鼠后足皮肤局部变化、厚度、温度及疼痛行为。在足底注射前，免疫复合物组及甲醛组随机各取5只大鼠鞘内注射SB203580(30 nmol∶10 μL)，而对照组取5只大鼠鞘内给予2%二甲 基 亚 砜 (dimethylsulfoxide，DMSO)10 μL。SB203580溶解于2%DMSO中(PBS稀释)。注射方法为乙醚麻醉下，穿刺针(直径0.4 mm)经由 L5－6椎间隙进入蛛网膜下腔，当穿刺针进入蛛网膜下腔时，大鼠会突然出现侧向摆尾现象或有脑脊液流出［4］。穿刺成功后，缓慢注入溶液(约1 min)。造模后12 h取所有大鼠脊髓(L4－5)采用Western blotting方法测定p38 MAPK总蛋白及p－p38 MAPK的表达。

5 疼痛行为(自发痛、机械触诱发痛反应)观察

方法见参考文献［5］。自发痛:动物置于有机玻璃特制的透明观测室内，适应20 min后，用摄像机记录30 min，统计后肢自发抬腿次数和持续时间。机械触诱发痛:动物置于特制网格平台上，不同强度的von Frey针丝，依次刺激右后足底皮肤，如大鼠产生明显缩爪或舔足，即为阳性反应。每只大鼠均从小强度的针丝开始刺激，每根针丝测量5次，至少能够引发3次缩爪反应的针丝强度即为机械痛阈值。每次测量时间1 s，尼龙丝弯曲弧度相同，以确保每次施加刺激相同。

6 p38 MAPK免疫印迹法(Western blotting)

在氯胺酮(2 mL/kg)麻醉下取L4－5脊髓。在置于干冰中的PBS混合液(含磷酸抑制剂及蛋白酶抑制剂)玻璃皿中进行组织均浆。均浆液加入DNase裂解30 min。取匀浆液(每泳道20 μg)进行SDSPAGE蛋白电泳，将蛋白质从SDS－PAGE凝胶转移至硝酸纤维素膜上，0.1%TBS洗膜5min×3次;5%脱脂奶粉于室温下封闭2 h，取膜，加入抗p38 MAPK抗体(1∶1000)、抗 p －p38 MAPK 抗体 (1∶1000)或β－actin(1∶2000)，4℃过夜。冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记的II抗工作液(羊抗兔IgG，1∶500，用封闭液稀释)37℃孵育1 h，0.1%TBS缓慢冲洗3次，充分显色后用清水终止反应。暗室中进行化学发光法显影;高敏感胶片摄片。图像分析软件定量分析靶蛋白及内参照β－actin条带含量，求其比值进行统计分析。

7 统计学处理

结 果

1 造模大鼠右后足局部皮肤反应及自发痛的比较

甲醛致痛大鼠注射后右后足立即出现明显红肿及缩足、舔足等自发痛行为，并持续至注射后1 h以上，而免疫复合物组及对照组大鼠自右后足底皮下注射后注射部位一直无红肿及自发痛表现。

2 造模大鼠右后足疼痛阈值的比较

2种致痛模型大鼠疼痛阈值均明显下降(P＜0.01，P＜0.05)，但甲醛组疼痛阈值下降迅速，于30 min达到低谷后逐渐缓解，免疫复合物组疼痛阈值下降缓慢，于注射后8 h达到低谷。注射后12 h时，甲醛组与免疫复合物组疼痛阈值接近(P＞0.05)，但仍明显低于对照组(P＜0.01)，见图1。

Figure 1.Pain threshold of rats without SB203580 treatment in the 3 groups after injection into the right hindpaw..n=5.*P ＜ 0.05，＊＊ P ＜ 0.01 vs control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs formalin.图1 未使用p38 MAPK抑制剂的各组大鼠右后足注射后不同时间疼痛阈值的比较

3 造模大鼠脊髓p38 MAPK蛋白表达量的变化

与对照组比较，2种致痛模型组p38 MAPK总体蛋白表达水平均无明显差异(P＞0.05)，但甲醛组大鼠激活态磷酸化的 p－p38表达明显上调(P＜0.01)。免疫复合物致痛组p－p38有少量表达，与对照组比无显著差异(P＞0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of total p38 MAPK and p－p38 MAPK in the L4－5segment of spinal cord in rats without SB203580 treatment in the 3 groups after injection into the right hindpaw.Lane 1:control;Lane 2:immune complex;Lane 3:formalin..n=10.＊＊P＜0.01 vs control or immune complex group.图2 右侧足底注射后3组大鼠模型脊髓p38－MAPK及p－p38 MAPK蛋白表达的比较

4 治疗大鼠局部皮肤反应及疼痛行为的比较

鞘内预先注射SB203580后，甲醛组大鼠自发痛行为及疼痛阈值降低均明显轻于未经治疗的同组大鼠(P＜0.05)，见图3A、B;而免疫复合物组及对照组中，使用SB203580并未对大鼠后足疼痛阈值造成明显影响(P ＞0.05)，见图3C、D。

Figure 3.Comparison of rat pain behavior between rats with SB203580 or without SB203580 in the same group after injection into the right hindpaw..n=5.*P＜0.05 vs formalin without SB203580.图3 使用p38MAPK抑制剂SB203580与未使用SB203580在足底注射后的大鼠疼痛行为的变化

讨 论

2004年Andoh首次提出IgG型免疫复合物可直接引起痛觉初级感觉神经元细胞兴奋［6］。此后又有人证实FcγRI可以表达于与疼痛相关的神经元上，而免疫复合物可直接激活神经元的FcγRI，导致钙内流增加，RMP去极化，动作电位释放产生慢性痛［3］。

本实验显示当一定浓度纯化的IgG型抗原抗体复合物注入大鼠后足后可以导致大鼠后足疼痛阈值出现明显下降，并持续12 h以上，而大鼠注射部位始终无红肿表现。这说明适宜浓度的IgG型特异性抗原复合物有效地诱导了大鼠疼痛，但在疼痛部位并未产生伤害性刺激并引起明显炎症反应。因此本实验的结果更支持非炎症致痛理论，即疼痛更可能是因抗原抗体复合物直接兴奋神经元细胞 Fcγ而产生。

普通炎症介质可以造成伤害性刺激并引起局部炎症反应促使释放大量致痛性炎症因子，这些炎症因子传递痛觉信息并导致疼痛异常［7］，而脊髓p38 MAPK信号通路的激活在促进炎症因子释放及病理痛的维持中有着重要作用［8－10］。甲醛致痛模型是常用的炎症性疼痛模型［11］，本实验结果显示甲醛所致炎症性疼痛大鼠注射部位立即出现明显红肿热痛的炎症反应，而脊髓p38 MAPK被显著激活，使用p38 MAPK抑制剂后，大鼠后足局部红肿症状明显减轻，且疼痛异常亦显著缓解，证实炎症反应以及脊髓p38MAPK信号通路在炎症性疼痛中起着关键性作用。

脊髓p38 MAPK通路在免疫复合物所致病理痛中并未明显活化，且使用p38 MAPK抑制剂对其疼痛并无影响，因此可以推论免疫复合物的大鼠疼痛与注射物造成的炎症反应及脊髓p38 MAPK通道无显著相关性。免疫复合物致痛无论在疼痛表现还是发病机制上都与甲醛致炎病症有着显著区别。

近年来关于免疫复合物致痛的研究极为少见，其致痛机制因被简单归为炎症性疼痛，未得到足够重视。而事实上这种疼痛在许多免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、干燥综合征、格林巴利等)中均有报道，且病程更长，治疗更为棘手［1，12］。本实验首次尝试建立特异性抗原免疫复合物致痛大鼠模型，并证实了此模型具有不同于普通炎症介质致痛特点。

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