三七皂苷单体R1抑制低氧高二氧化碳诱导的肺动脉平滑肌细胞p38 MAPK信号通路的活化*

王淑君，刘立宾，黎关龙，王园园，周俊辉，赵 珊，刘亚坤，王万铁△

(温州医学院1病理生理学教研室，2检验医学院，浙江 温州 325035;3浙江省中西医结合医院结核化验室，浙江 杭州 310003)

国内外研究证实缺氧性肺动脉收缩反应(hypoxic induced pulmonary vasoconstriction，HPV)是慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)的始动因素，但COPD等的肺循环缺氧状态常同时伴有二氧化碳潴留，因此研究低氧高二氧化碳性肺动脉收缩(hypoxic hypercapnia－induced pulmonary vasoconstriction，HHPV)的发生机制更具理论和实践意义。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶，主要包括细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK 1/2)和p38 MAPK。以往研究表明肺动脉高压的发生可能与该通路的激活有关［1－2］。

三七总皂苷(panax notoginseng saponin，PNS)为三七的主要有效成分，具有降压［3］、钙拮抗［4－5］等作用，三七皂苷单体 R1(notoginsenoside monomer R1，R1)为其主要单体成分对肺血管的作用未见报道。我们课题组前期研究［6－7］表明 PNS可通过抑制MAPK通路减轻大鼠低氧高二氧化碳性肺动脉高压的形成。R1在低氧高二氧化碳性肺血管收缩和肺动脉高压的形成过程中是否起作用?其作用机制如何?为此，我们选择了MAPKs通路中的p38 MAPK通路，采用不同浓度R1对低氧高二氧化碳条件下肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)进行干预，观察p38 MAPK蛋白的磷酸化水平及p38 MAPK mRNA水平，探讨R1的可能作用机制，以期为R1临床治疗缺氧和高碳酸血症引起的肺血管收缩及肺动脉高压提供必要的实验依据和理论基础。

材料和方法

1 动物和药品

SPF级标准健康雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠10只，体重200～220 g，由温州医学院实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(浙)2008－0156号。R1由吉林大学基础医学院有机化学教研室提供，纯度＞98%，溶于DMSO，10 g/L，存于4℃;DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco;台盼蓝购自Sigma;RT－PCR试剂盒、平滑肌 α－actin单克隆抗体、SABC－FITC(POD)双标试剂盒和浓缩型二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)试剂盒购自 TaKaRa;兔抗鼠磷酸化p38 MAPK(p－p38 MAPK)、兔抗鼠p38 MAPK和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔Ⅱ抗购自Cell Signal Technology;BCA蛋白定量试剂盒和增强化学发光试剂盒购自Pierce;其余试剂为国产分析纯。

2 方法

2.1 PASMCs原代培养 颈椎脱臼法处死大鼠，75%乙醇中浸泡，超净平台内解剖显微镜直视下取2～4级肺动脉，无菌棉签去内皮细胞，37℃下0.2%胶原酶Ⅰ消化约2～4 h，离心弃上清，用20%胎牛血清DMEM漂洗沉淀，在漂洗的培养皿中会脱落大量单个平滑细胞，将此培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，第2 d细胞贴壁，7 d传代。

2.2 PASMCs的鉴定

2.2.1 细胞形态鉴定 倒置相差显微镜下观察细胞形态并摄片。

2.2.2 免疫细胞化学鉴定 参照SABC－POD免疫组化试剂盒说明操作。光镜观察细胞核染成棕黄色为阳性，每张玻片在显微镜下放大200倍随机选取3个视野计数，用阳性细胞数占细胞总数的百分比即阳性率表示细胞纯度，达95%以上方可用于实验。

2.3 药物干预及实验分组 取第2～5代生长良好的对数生长期PASMCs，制成细胞悬液，按5×108/L细胞密度接种于6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养，待融合成单层细胞时(约80%铺满)换成无血清培养基饥饿24 h，然后行药物干预(30 min内完成加药操作)。分组:(1)常氧(normoxia，N)组:不予任何干预因素;(2)低氧高二氧化碳(hypoxic hypercapnia，H)组:低氧高二氧化碳干预;(3)DMSO对照组(HD):低氧高二氧化碳+0.05%DMSO干预;(4)R1干预组(R8、R40、R100):低氧高二氧化碳 +8、40、100 mg/L R1。予 N组5%CO2、21%O2气体条件，37℃孵育24 h;予H、HD组及R1干预组6%CO2、1%O2气体条件，37℃孵育24 h。

2.4 蛋白免疫印迹法检测PASMCs p－p38 MAPK蛋白含量 弃培养液，用预冷的PBS清洗3次，每孔加入细胞裂解液100 μL，冰面上裂解30 min，12000 r/min、4℃ 离心5 min，取上清液，BCA法蛋白定量。以10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿式电转移法转移至PVDF膜，室温下用封闭液封闭2 h后加入Ⅰ抗兔抗鼠p38 MAPK和p－p38 MAPK多克隆抗体(1∶1000稀释)，4℃ 反铺法孵育过夜，抗兔IgGⅡ抗(1∶4000稀释)反应2 h，ECL化学发光法显色，X射线底片曝光。实验重复8次，p38 MAPK蛋白作为内参照。

2.5 半定量RT－PCR检测p38 MAPK mRNA的表达 弃培养液，预冷PBS清洗3次，每孔加700 μL Trizol，反复吹打，至液体澄清，转至EP管静置，加氯仿，剧烈颠倒混匀，静置，4℃、12000 r/min离心，转含RNA上层水相于另一EP管，加冰冷异丙醇，适度颠倒混匀，静置，4℃、12000 r/min离心，弃上清，加预冷75%乙醇，4℃、7500 r/min离心，弃上清，空气干燥，溶于DEPC水，于核酸浓度检测仪测定RNA浓度，逆转录合成cDNA，PCR扩增反应:p38上游序列5'－TCCAAGGGCTACACCAAATC －3'，下游序列5'－TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC－3'，反应条件为预变性94 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，最后72℃ 10 min，扩增片段为341 bp;β－actin上游序列5'－GAGACCTTCAACACCCCAGCC －3'，下游序列5'－ TCGGGGGATCGGAACCGCTCA －3'，反应条件为预变性94℃ 2 min，98℃ 10 s，53℃ 15 s，72℃30 s，最后再72℃ 10 min，扩增片段为400 bp。

3 统计学处理

结 果

1 原代培养大鼠PASMCs的分离和培养及鉴定

1.1 形态学观察细胞生长特点 原代培养5～7 d呈典型的“峰－谷”状生长，镜下显示细胞呈梭形，连续培养多代仍可保持较好状态，见图1A、B。

1.2 免疫细胞化学染色法鉴定PASMCs 经平滑肌α－actin免疫细胞化学染色后，胞浆着色，约98%呈阳性反应，即高倍镜下可见胞浆内大量棕黄色、与细胞长轴平行的纤维细丝，此为平滑肌α－actin，核卵圆形居中，呈淡蓝色，见图1C。

Figure 1.Identification of rat PASMCs.A:primarily cultured rat PASMCs(×200);B:primarily cultured rat PASMCs(×400);C:expression of smooth muscle α－actin in rat PASMCs(immunocytochemical staining，×400).图1 原代培养大鼠PASMCs的鉴定

2 各组细胞p－p38 MAPK相对表达量比较

N组p－p38 MAPK蛋白弱表达。与HD组相比，R1各浓度组p38MAPK表达水平均显著下调(P＜0.05)。各浓度组之间p－p38 MAPK表达呈浓度依赖性，R100组 ＜R40组 ＜R8组，R100组和 R8组之间差异有统计学意义(P＜0.05)，二者与R40组之间均无显著差异(P＞0.05)，见图2。

3 各组细胞p38 MAPK mRNA相对表达量比较

N组p38 MAPK mRNA表达较HD组和R1各浓度组均明显减弱(P＜0.05)。各浓度组之间p38 MAPK mRNA表达呈浓度依赖性，R100组＜R40组＜R8组，R100组和R8组之间差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

Figure 2.Expression of p－p38 MAPK protein in rat PASMCs from different groups..n=8.＊＊P＜0.01 vs N;△△P ＜0.01 vs H;▲▲P ＜0.01 vs HD;##P ＜0.01 vs R8.图2 各组大鼠PASMCs p－p38 MAPK蛋白的表达

Figure 3.Expression of p38 MAPK mRNA in rat PASMCs from different groups.M:marker..n=8.＊＊P＜0.01 vs N;△△P＜0.01 vs H;▲▲P ＜0.01 vs HD;#P ＜0.05 vs R8.图3 各组大鼠PASMCs p38 MAPK mRNA的表达

4 PASMCs p－p38 MAPK蛋白表达与p38 MAPK mRNA表达的相关性分析

R1各干预组p－p38 MAPK蛋白与p38 MAPK mRNA呈正相关(r=0.958，P＜0.01)，见图4。

讨 论

Figure 4.The correlation analysis between p－p38 MAPK protein and p38 MAPK mRNA in all groups(r=0.958，P ＜0.01).图4 各组大鼠PSAMCs p－p38 MAPK蛋白与p38 MAPK mRNA的相关分析

目前认为低氧高二氧化碳引起HHPV的机制主要有两大假说［8］:其一介质学说，即低氧为低氧通过释放血管收缩剂和血管扩张剂而激发HPV，主要包括一氧化氮(NO)、钙基因相关肽(CGRP)的舒血管效应，内皮素(ET)的缩血管效应和缓激肽(BK)、组胺的舒缩双重作用;其二为直接学说，即低氧直接作用于PASMCs使其发生收缩而引起HPV，即低氧情况下，钾通道、钙通道、氯通道通过一系列复杂的分子和电生理机制，最终导致细胞内Ca2+浓度升高，触发兴奋－收缩偶联机制，使PASMCs收缩［9］。现在普遍认为，在HPV的形成发展中，后一学说占主导地位，前者仅参与调节HPV的程度。低氧是引起PASMCs增殖的重要因素，是其凋亡减少的重要原因之一，肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的失衡参与了肺动脉高压的发生过程，其主要机制为直接增加PASMCs代谢或通过增加细胞内钙离子浓度等途径实现［10］。

我们之前的研究表明三七总皂苷是一种钙拮抗剂，且能够通过抑制p38 MAPK通路活性减轻肺动脉高压的程度。近年来的研究发现，其主要成分单体R1具有相似或相近的作用。本实验中，我们分析实验结果发现:低氧高二氧化碳条件下分别予低、中、高浓度 R1孵育后，肺动脉平滑肌细胞 p－p38 MAPK蛋白表达均明显低于低氧高二氧化碳和DMSO对照组，而且mRNA表达变化与蛋白基本一致，二者呈显著正相关。这提示R1为三七总皂苷减轻肺动脉高压的有效作用成分，可能通过降低 p38 MAPK通路的活化，从而抑制低氧性肺平滑肌细胞收缩，进而起到缓解肺动脉高压的形成以及肺血管重建的作用。陈重华等［11］报道R1能显著改善正常小鼠耳廓微循环并延长凝血时间，其机制是使细动脉和细静脉的血管口径显著增大，能使耳廓毛细血管开放数量明显增多。

此外，我们的结果还显示:作用于p38 MAPK通路的R1最佳浓度为100 mg/L。有研究报道较低浓度(0.5～3 g/L)PNS促进血管平滑肌细胞增殖，较高浓度(6 g/L)则抑制增殖诱发凋亡，可能与激活JNK1/2磷酸化通路有关［12］。这种双向作用提示不同浓度药物可能激活或抑制不同的MAPK通路，影响细胞增殖与凋亡。

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