大鼠部分肝切除术后Hedgehog信号分子的表达*

金 海，刘慧玲，李学俊，冯智英，王 冰，杨建旭，汪根树△，吴 斌

(中山大学附属第三医院1肝脏移植中心，中山大学器官移植研究所，广东省器官移植中心，2消化内科，3肝病内科，4病理科，广东 广州 510630)

Hedgehog(Hh)信号通路是动物发育过程中重要的细胞间通讯，可调节许多成体组织器官干细胞的自我更新与增殖，维持正常的组织器官形态和功能。在组织器官损伤时Hh信号通路被激活，促进组织干细胞的分化和增殖以修复损伤。对人和鼠的研究显示，多种肝脏损伤时出现Hh信号通路相关蛋白表达，提示Hh信号可能被激活，通过刺激肝脏干细胞分化增殖以修复肝脏损伤［1－2］。Hh信号通路是否参与了部分肝脏切除术后的肝再生罕有研究报道。本研究建立大鼠部分肝脏切除术模型，检测术后肝脏Hh信号通路相关蛋白Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和 Glioblastoma－2(Gli－2)的表达，探讨Hh信号通路在部分肝脏切除术后肝再生中的作用。

材料和方法

1 材料

清洁级健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠18只，重200～250 g，购自中山大学动物实验中心。主要试剂和仪器包括:二步法抗兔/鼠通用型Ki－67免疫组化检测试剂盒(GK500705，基因科技公司)，鼠来源Shh单克隆抗体(s8321，Sigma)，兔来源Ihh单克隆抗体(ab52919，Abcam)，兔来源 Gli－2多克隆抗体(sab2900411，Sigma)，倒置显微镜和照相系统(Leica)。术前禁食12 h，禁水4 h。

2 方法

2.1 大鼠部分肝切除模型的建立 10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔内注射麻醉大鼠，固定，腹部备皮，Ⅲ型安尔碘消毒腹部，取中上腹部正中切口，切开腹壁各层，切断肝周韧带，充分暴露肝脏，先用7－0丝线结扎各肝叶Glisson系统，然后用3－0丝线结扎肝蒂后切断肝叶。切除肝左内侧叶、左外侧叶、中叶，约占大鼠全肝重量的70%。腹部给予2～3 mL生理盐水补充术中失水，然后用3－0丝线连续缝合腹部切口关腹。术后保暖，单笼饲养，自由饮水进食。

2.2 实验分组和标本采集 18只SD大鼠随机均分为3组:假手术组(A)、部分肝切除术组1(B)、部分肝切除术组2(C)。A、B组于术后24 h、C组于术后48 h按照前述方法开腹切取肝组织。取材方法:小心取下剩余肝叶(右外叶、三角叶和乳头叶)，用温生理盐水冲洗3次，分成均衡的两部分，一部分用4%中性福尔马林固定，另一部分用冻存管装好保存在液氮罐内。

2.3 检测指标和检测方法 检测指标包括肝组织HE染色和肝组织 Ki－67、Shh、Ihh、Gli－2的表达。肝组织切片行常规苏木素和伊红染色法检测组织病理损伤，由专业病理科医师进行结果判断;肝组织Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2的表达采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶连结法检测(免疫组化法)和 Western blotting法。Ki－67、Shh、Ihh 和 Gli－2免疫组化阳性结果判断:细胞质(Shh、Ihh)或细胞核(Ki－67、Gli－2)呈现棕褐色颗粒状染色为阳性反应。

3 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差()表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD－t检验。

结 果

1 肝组织HE染色

HE染色显示A组肝细胞和肝小叶形态结构正常;B组可见肝窦扩张淤血和肝细胞水肿，并可见点状坏死，肝索、肝小叶结构基本正常;C组除肝窦扩张淤血、肝细胞水肿、点状坏死之外，还可见肝索排列紊乱，肝小叶结构基本正常，另可见处于不同分裂期细胞，见图1。

2 肝组织Ki－67、Shh、Ihh和 Gli－2的表达

用免疫组织化学法检测肝细胞Ki－67的表达评估各组术后肝脏的再生情况。B、C组Ki－67表达明显高于 A组(P＜0.01)，C组高于 B组(P＜0.01)，见图2、表1。用免疫组织化学法检测肝细胞Shh、Ihh和Gli－2的表达评估术后各组肝脏Hh信号通路的表达情况。B、C组Shh、Ihh和Gli－2表达高于A组(P＜0.01)，C组高于B组(P＜0.01)，见图3、表1。用Western blotting法检测肝组织中Shh、Ihh的表达情况，其结果与免疫组化结果一致，见图4。各组别数据显示Shh、Ihh和Gli－2表达强度与肝脏细胞增殖程度一致。

Figure 1.HE staining of rat liver tissues in each group(×400).A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).图1 各组别HE染色结果

Figure 2.A proliferation marker，Ki－67，was evaluated using immunohistochemistry in each group(×400).Ki－67 positive cells are brown.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).图2 增殖细胞标志物Ki－67在各组的表达情况

Figure 3.Expression of Hh ligands(Shh，Ihh)and Hh transcription factor(Gli－2)in rat livers in each group(×400).Shh，Ihh and Gli－2 positive cells are brown.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).图3 各组Shh、Ihh和Gli－2的表达情况

表1 各组Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2阳性细胞数Table 1.The number of Ki－67，Shh，Ihh and Gli－2 positive cells in the liver from each group(.n=6)

表1 各组Ki－67、Shh、Ihh和Gli－2阳性细胞数Table 1.The number of Ki－67，Shh，Ihh and Gli－2 positive cells in the liver from each group(.n=6)

Fifteen randomly－chosen fields(×400)in each section were evaluated.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(24 h);C:partial hepatectomy(48 h).＊＊P ＜0.01 vs group A;##P ＜0.01 vs group B.

Group Ki－67 Shh Ihh Gli－2 A 4.17±1.47 6.17±1.47 11.83±1.94 6.83±1.60 B 14.33±2.25＊＊ 10.17±1.72＊＊ 20.17±1.17＊＊ 27.83±6.74＊＊C 115.00±4.56## 30.50±1.64## 38.17±4.12##67.50±12.11##

Figure 4.Expression of Hh ligands(Shh，Ihh)examined by Western blotting in rat livers in each group.A:sham operation group;B:partial hepatectomy(48 h);C:partial hepatectomy(24 h).图4 各组Shh和Ihh的表达情况

讨 论

Hh信号通路［3］由Hedgehog配体、2个跨膜蛋白受体Patched(Ptch)和 Smoothened(Smo)，以及下游转录因子Gli蛋白等组成。在哺乳动物中存在3种Hh成员，即 Shh、Ihh 及 Desert Hedgehog(Dhh)，均为分泌性蛋白。Ptch和Smo是位于细胞膜上的跨膜蛋白，其中Ptch为Hedgehog的受体，能与3种Hh蛋白结合。当不存在Hh蛋白时，Ptch抑制Smo的活性进而抑制下游基因的转录表达。当Hh蛋白与Ptch结合时，Ptch对Smo的抑制效应被解除，激活下游的转录调节因子Gli，即可诱导目标基因的表达。Hh信号通路可调节许多成体组织器官干细胞的自我更新与增殖，维持正常的组织器官形态和功能。

对人类原发性胆汁性肝硬化、酒精性肝病和对大鼠胆管结扎、酒精性和非酒精性脂肪肝、乙硫氨酸中毒肝脏以及缺血再灌注肝脏模型的研究［4－6］显示，各种肝脏损伤时肝脏组织中出现Hh信号通路相关蛋白和肝脏干细胞标志物表达，推测肝损伤时Hh信号通路可能被激活，通过刺激肝干细胞和肌纤维母细胞的分化和增殖以修复肝脏损伤。体外实验发现Shh可以抑制小管细胞凋亡，Hh信号通路抑制剂可以抑制培养的肝母细胞瘤的生长［7］。

在部分肝切除术后肝脏组织缺损，肝再生可以部分或全部恢复肝脏原来体积和形状，其中包括肝细胞、胆管和血管等组织的再生修复。在活体部分供肝移植和劈离式肝移植术后［8］，移植肝脏通常能迅速再生，部分或全部恢复肝脏原来体积和形状。肝脏这种再生修复组织缺损的机理尚不明确。较早的研究认为肝损伤后肝再生要依赖于分化成熟的肝细胞重新活化增殖。肝脏损伤后可分泌相关调控因子(如 tumor necrosis factor α、interleukin － 6、cyclin D1、immediate early gene、hepatocyte growth factor等)刺激肝细胞再活化增殖，修复损伤［9－11］。目前认为肝损伤是由肝干细胞增生和分化来修复的。肝干细胞是肝组织中具有自我更新和分化为肝细胞、胆管上皮细胞等多种细胞的不成熟细胞，在生理条件下负责更新衰老死亡的肝组织细胞，维持肝脏结构和功能的完整性;在病理条件下如肝组织缺损、细胞坏死等，肝干细胞可增生和分化修复肝损伤。成年肝脏上皮祖细胞为Hh反应细胞。胚胎期和成年灵长类肝脏的各型上皮祖细胞都能产生Hh配体或对之应答。

本实验显示在部分肝切除术后，残肝组织中出现细胞水肿和坏死，至48 h可见处于不同分裂期细胞，细胞增生标志物Ki－67开始表达，说明肝脏干细胞开始增殖以修复肝组织缺损。本实验还显示在部分肝切除术后，残肝组织中可见 Hh信号蛋白Shh、Ihh和Gli－2的表达，且它们的表达强度与肝细胞增生标志物Ki－67的表达程度一致。提示在部分肝切除术后Hh信号通路被激活，可能诱导肝脏干细胞分化和增殖，修复肝脏缺损。这与Ochoa等［11］报道Hh信号通路在部分肝切除术后激活并可能促进肝脏再生的结果一致。

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