索拉非尼抑制人肝星状细胞胶原合成*

2012-07-31高俊茶姜慧卿

中国病理生理杂志 2012年1期

高俊茶，王妍，姜慧卿△

(1河北医科大学第二医院消化科，河北省消化病重点实验室，河北省消化病研究所，2河北省人民医院消化内科，河北石家庄 050051)

肝纤维化系指肝组织内细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度增生与异常沉积，其中尤以I型胶原为主［1］，最终导致肝脏结构和功能异常的病理变化，进而发展为肝硬化。而活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)合成和分泌细胞外基质，是肝纤维化发生发展的中心环节。我们之前的研究发现酪氨酸激酶活化与肝纤维化的发生有关，索拉非尼(sorafenib)是一种强效多靶点酪氨酸激酶抑制剂，以Raf、血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)和血小板源性生长因子受体(platelet－derived growth factor receptor，PDGFR)为靶点发挥抑制细胞增殖和血管生成的双重作用［2］。我们的研究发现索拉非尼可抑制肝纤维化大鼠肝脏胶原的合成和分泌，在体外抑制肝星状细胞增殖，促进肝星状细胞凋亡［3］;其在体外对肝星状细胞胶原合成的影响尚需进一步研究。本文旨在应用索拉非尼干预人肝星状细胞，在体外研究索拉非尼对肝星状细胞胶原合成的影响，以期为寻找防治肝纤维化药物提供实验依据。

材料和方法

1 材料

1.1 肝星状细胞株人肝星状细胞细胞株LX－2由美国Scott L.Friedman教授惠赠。

1.2 主要试剂索拉非尼购自Alexis;PDGF购自PeproTech;DMEM和 FBS购自 Gibco;L－［2，3－3H］－脯氨酸和闪烁液均购自PerkinElmer;I型胶原多克隆抗体购自Santa Cruz;SP试剂购自北京中山生物技术公司;RNA提取试剂Trizol reagent购自Invitrogen;逆转录酶(AMV－RT)、核糖核酸酶抑制剂(RNasin)、dNTP、Taq DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)、随机引物(random primers)和琼脂糖(agarose)均购自Promega。

2 方法

2.1 肝星状细胞的体外培养将冷冻保存于液氮中的肝星状细胞复苏后接种于含10%胎牛血清、1×105IU·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素、4 mmol·L－1谷氨酰胺及1 mol·L－1HEPES的DMEM培养液中，37℃、5%CO2培养至细胞呈单层接近融合时进行实验。每次实验均在呈指数生长的细胞中进行，接种(3×107)～(5×107)·L－1细胞于25 cm2培养瓶或以2.0 ×107·L－1的密度接种 1.5 mL 制备细胞爬片，或以2.5×107·L－1的密度1 mL接种于24孔板，培养箱中孵育至细胞接近80% ～90%融合时，换不含胎牛血清的DMEM培养液继续培养24 h，使细胞同步化于G0期后进行分组。

2.2 免疫细胞化学法检测I型胶原蛋白的表达取呈指数生长的肝星状细胞制备细胞爬片。按上述方法进行同步化后分组如下:(1)对照组;(2)PDGF组(PDGF 100 μg·L－1);(3)PDGF+sorafenib(10.0 μmol·L－1)组。加入处理因素后24 h收集细胞爬片，单层肝星状细胞爬片经4%多聚甲醛固定，3%过氧化氢室温孵育，微波炉抗原修复，5%正常羊血清封闭后，加入Ⅰ抗体I型胶原多克隆抗体1∶100，37℃孵育1 h，PBS清洗，加辣根过氧化物酶复合物孵育50 min后，DAB显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果判定:细胞内棕褐色染色为阳性。阴性对照用PBS替代Ⅰ抗。应用麦克奥迪数码医学图像分析系统测量I型胶原蛋白的阳性表达，以阳性平均吸光度值计算表达强度。

2.3 ［3H］脯氨酸掺入实验测定细胞胶原合成能力依据文献［4］介绍的方法稍作修改，测定［3H］－脯氨酸的掺入。肝星状细胞同步化后分组如下:(1)对照组;(2)PDGF 组(PDGF 20 μg·L－1);(3)PDGF+sorafenib(2.5 μmol·L－1)组;(4)PDGF+sorafenib(5.0 μmol·L－1)组;(5)PDGF+sorafenib(10.0 μmol·L－1)组;(6)sorafenib(2.5 μmol·L－1)组;(7)sorafenib(5.0 μmol· L－1)组;(8)sorafenib(10.0 μmol·L－1)组。每组平行设 6 个复孔，PDGF的浓度均为20 μg·L－1，在相应时点收集细胞。实验终止前24 h每孔加入L－［2，3－3H］－脯氨酸1.85 ×104Bq。在 PDGF(20 μg·L－1)刺激 2 h 后或是在没有PDGF作用下，分别加入不同浓度sorafenib(2.5 μmol·L－1、5.0 μmol·L－1和 10.0 μmol·L－1)作用12 h、24 h及48 h后收集上清液，每孔上清液等分为2份，分别移入2 mL Eppendorf管:一管加I型胶原酶0.5 g·L－1，另一管为空白对照管，置37℃恒温作用90 min;之后每管加50%三氯醋酸500 μL冰上作用1 h，并于4℃、5000 r/min离心10 min去上清，每管加入2 mL闪烁液溶解沉淀物，置于闪烁杯中，于液体闪烁记数仪上测定样品counts/min值。按照下列公式计算:

胶原含量=空白管沉淀物counts/min－胶原酶管沉淀物counts/min。

［3H］脯氨酸掺入率(%)=(实验组放射性活度/对照组放射性活度)×100%。

［3H］脯氨酸掺入抑制率(%)=［(对照组放射性活度－实验组放射性活度)/对照组放射性活度］×100%。

2.4 Real－time PCR检测 I型胶原 α1 mRNA表达水平取呈指数生长的细胞按上述方法进行同步化分组如下:(1)对照组;(2)PDGF组;(3)PDGF+sorafenib(2.5 μmol·L－1)组;(4)PDGF+sorafenib(5.0 μmol·L－1)组;(5)PDGF+sorafenib(10.0 μmol·L－1)组，PDGF 均为 100 μg·L－1，加入处理因素后24 h收集细胞。采用Trizol试剂盒，按照说明书操作，一步法提取人肝星状细胞总RNA，电泳鉴定RNA并定量，逆转录合成cDNA;I型胶原α1及内参照甘油醛－3－磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物参照GenBank基因序列自行设计，由上海生物工程公司合成。引物设计与合成如下:I型胶原α1链上游引物5'－CAGGCTGGTGTGATGGGATT－3'，下游引物 5'－CCAAGGTCTCCAGGAACACC－3'，扩增产物大小为279 bp。GAPDH上游引物5'－ACTTTGGTATCGTGGAAGGACT－3'，下游引物 5'－ GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT－3'，扩增产物大小为133 bp。在PE 5700实时荧光定量PCR仪(ABI)上进行实时定量扩增。SYBR反应体系40 μL。PCR反应条件:96℃ 4 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40 个循环;72℃ 延伸5 min。利用实时荧光定量PCR仪自带软件进行分析，获得产物的 Ct值。采用2－ΔΔCt法分析实时定量PCR基因表达的相对变化。

3 统计学处理

结果

1 索拉非尼抑制LX－2细胞I型胶原蛋白表达

免疫细胞化学染色显示:PDGF刺激使LX－2细胞I型胶原蛋白表达增加，而索拉非尼干预24 h能够明显降低I型胶原蛋白的表达;对照组、PDGF刺激组和索拉非尼干预组I型胶原平均吸光度分别为0.244±0.022、0.340±0.023和0.224±0.017(P＜0.01)，差异有统计学意义，见图1。

2 索拉非尼抑制LX－2细胞［3H］－脯氨酸掺入率的量效关系

析因设计的方差分析显示，PDGF和索拉非尼无交互作用(P ＞0.05);20 μg·L－1PDGF作用 LX －2细胞48 h可使［3H］－脯氨酸掺入率增加1.2倍(P＜0.01)，差异有统计学意义;2.5 ～10.0 μmol·L－1索拉非尼48 h后对LX－2细胞［3H］－脯氨酸掺入有抑制作用(P＜0.01);无论有无PDGF的刺激，索拉非尼在2.5 ～10.0 μmol·L－1范围内，浓度越高，对肝星状细胞［3H］－脯氨酸掺入的抑制作用越强(P＜0.01)，见表1，表明索拉非尼对肝星状细胞胶原合成的抑制作用呈剂量依赖关系。

Figure 1.Sorafenib inhibits type I collagen expression increased by PDGF in LX－2 cells(immunocytochemical staining，× 400).A:control;B:PDGF(100 μg/L);C:PDGF+sorafenib(10.0 μmol/L).图1 免疫细胞化学法检测LX－2细胞经PDGF刺激及索拉非尼干预24 h后I型胶原的表达

表1 索拉非尼呈浓度依赖性抑制LX－2细胞［3H］－脯氨酸掺入率Table 1.Sorafenib dose－dependently inhibited［3H］－proline incorporation rate in LX－2 cells(%..n=6)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs PDGF group.

Control 100.00 ±0.00 PDGF(20 μg/L) 120.80 ±15.40#PDGF+sorafenib(2.5 μmol/L) 84.19 ±10.83*PDGF+sorafenib(5.0 μmol/L) 68.35 ±7.86*PDGF+sorafenib(10.0 μmol/L) 52.05 ±13.56*Sorafenib(2.5 μmol/L) 70.67 ±12.19#Sorafenib(5.0 μmol/L) 56.60 ±14.97#Sorafenib(10.0 μmol/L) 31.55 ±8.70#

3 索拉非尼抑制LX－2细胞［3H］－脯氨酸掺入率的时效关系

索拉非尼可以抑制LX－2细胞的［3H］－脯氨酸掺入作用，随着时间延长，10.0 μmol·L－1索拉菲尼对肝星状细胞［3H］－脯氨酸掺入抑制率逐渐增加，在12 h、24 h和48 h［3H］－脯氨酸掺入抑制率分别为22.69%、37.52%和71.74%(P＜0.01)，见表2，表明索拉非尼抑制人肝星状细胞胶原合成具有时间依赖关系。

4 索拉非尼抑制LX－2细胞I型胶原 α1 mRNA的表达

在real－time PCR实验中，以荧光值和循环数作图，自动得到mRNA水平扩增曲线，可见各样品的重复性较好，扩增效率基本一致。应用相对定量2－ΔΔCt法比较I型胶原 α1 mRNA在不同分组中的表达。结果表明:100 μg·L－1PDGF作用于LX－2细胞24 h，显著增加I型胶原α1 mRNA表达，索拉非尼干预可以抑制 I型胶原 α1 mRNA表达，在2.5～10.0 μmol·L－1范围内，索拉非尼呈剂量依赖性地抑制100 μg·L－1PDGF 诱导的 I型胶原 α1 mRNA 的表达上调(2.14±0.13，1.78±0.04，0.94±0.10 vs2.79 ±0.12，P＜0.01)，差异有统计学意义，见图2和表3。

表2 索拉非尼 (10.0 μmol/L)呈时间依赖性提高LX－2细胞［3H］－脯氨酸掺入抑制率Table 2.Sorafenib(10.0 μmol/L)time － dependently increased the inhibitory rate of［3H］－proline incorporation in LX－2 cells(%..n=6)

#P ＜0.05 vs 0 h;*P＜0.05 vs 12 h;△P ＜0.05 vs 24 h.

Time(h)Inhibitory rate 0.00 ±0.0012 22.69 ±4.41#24 37.52 ±6.10#*48 71.74 ±6.37#＊△0

Figure 2.The mRNA expression of collagen α1(I)after different interventions in LX－2 cells..n=6.#P＜0.05 vs control;*P ＜0.05 vs PDGF group.图2 索拉非尼和PDGF对LX－2细胞I型胶原α1 mRNA表达的影响

表3 索拉非尼呈剂量依赖性抑制PDGF诱导的I型胶原α1 mRNA的表达Table 3.Sorafenib inhibited collagen α1(I)mRNA expression increased by PDGF in a dose－dependent manner detected by real－time PCR(.n=6)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs the PDGF group.

Control 1.03 ±0.23 PDGF(100 μg/L) 2.79 ±0.12#PDGF(100 μg/L)+sorafenib(2.5 μmol/L)2.14 ±0.13*PDGF(100 μg/L)+sorafenib(5.0 μmol/L)1.78 ±0.04*PDGF(100 μg/L)+sorafenib(10.0 μmol/L)0.94 ±0.10)*

讨论

索拉非尼是一种新型口服强效多靶点酪氨酸抑制剂，以 Raf、VEGFR和 PDGFR为靶点，通过阻断Ras/Raf/MAPK(mitogen activated protein kinase)和PI3K(phosphatidylinositol 3－kinase)/Akt信号通路而抑制肿瘤细胞增殖和血管生成［2，5］。Ras/Raf/MAPK和PI3K/Akt信号通路是调控肝纤维化发生发展的2条重要信号途径。李骢等［6］发现中药肝复康通过非特异性干扰PDGF功能，阻断Ras/MAPK通路，抑制I型胶原和α－平滑肌肌动蛋白(α－smooth muscle actin，α－SMA)mRNA的转录，以达到抗纤维化的作用。研究发现索拉非尼能够降低肝纤维化大鼠门脉压力、减轻肝纤维化和改善肝功能［7－9］。索拉非尼对肝星状细胞胶原合成的影响目前尚不甚清楚，我们采用一种研究人肝纤维化的理想细胞模型LX－2，体外研究索拉非尼对肝星状细胞胶原合成的影响。

通过［3H］－脯氨酸掺入实验发现，无论在PDGF刺激或非刺激情况下，LX－2细胞胶原合成均明显受到抑制，且抑制程度与索拉非尼浓度呈剂量和时间依赖关系，表明索拉非尼对LX－2细胞胶原合成有显著抑制效应，而抑制肝星状细胞胶原合成又是肝纤维化逆转的关键。我们的前期研究发现:索拉非尼能减轻胆总管结扎和二甲基亚硝胺所致肝损伤大鼠的纤维化程度。最近Thabut等［10］通过磁共振、组织化学等方法也发现索拉非尼对胆总管结扎慢性肝损伤大鼠肝脏细胞外基质的重塑具有调节作用，认为对以大量纤维组织和新生血管增生为特征的慢性肝病是一种很好的治疗选择，可见索拉非尼这种在体内外均具有的抑制肝纤维化发生的作用使其成为一种极具潜力的肝纤维化治疗药物。

以I型胶原为主的ECM在肝脏内过度增生与沉积是肝纤维化的主要特征，活化的肝星状细胞是其主要来源［1，11］。人肝星状细胞细胞株LX－2表达I型胶原α1，而活化肝星状细胞中I型胶原α1的表达在肝纤维化形成中起着关键作用。杨雅丽等［12］发现PDGF－B反义寡脱氧核苷酸可以抑制肝星状细胞的增殖、I型胶原的合成。动物实验研究表明:随着肝纤维进展，肝星状细胞活化增殖，I型胶原α1、α2 mRNA表达上调，胶原合成增加［13］。应用S－亚硝基－N－乙酰半胱氨酸干预发现，随着肝纤维化减轻，I型胶原 α1和 α －SMA 表达下调［14］。Lee等［15］应用脂质分化相关蛋白(adipose differentiation－related protein，ADRP)质粒载体可使活化肝星状细胞恢复到静止状态，α－SMA表达降低，发现伴随着肝星状细胞失活，I型胶原mRNA表达下调，肝纤维化程度减轻;而用siRNA抑制ADRP表达可以使上述变化逆转。Panakanti等［16］应用三聚寡核苷酸多肽(triplex forming oligonucleotides，TFO)干预胆总管结扎肝纤维化大鼠，发现在减轻肝纤维化的同时I型胶原基因表达受到抑制。本研究发现索拉非尼可以显著降低LX－2 I型胶原α1 mRNA表达水平，且呈明显的量效关系;与此同时免疫细胞化学方法也证明了sorafenib可以显著抑制I型胶原蛋白的表达，表明索拉非尼在蛋白水平和mRNA水平均能够抑制I型胶原表达。

索拉非尼作为一种小分子多靶点的生物靶向治疗新药，能够从蛋白和mRNA水平抑制I型胶原表达，对人肝星状细胞胶原合成有显著抑制效应，表明索拉非尼有可能成为预防和治疗肝纤维化的一种新药物。

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