卵巢上皮癌中细胞外信号调节激酶的表达及其与预后的关系*

倪 娟，陈亚侠，卢红鲜，程 蓓，万小云，谢 幸

(1杭州师范大学附属医院妇科肿瘤科，浙江 杭州 310015;2浙江大学医学院附属妇产科医院妇科肿瘤科，浙江 杭州 310006)

卵巢上皮癌是妇科癌症最主要的死亡原因，晚期患者的5年生存率仅为30%［1］。近年来研究表明，卵巢上皮癌的发生与细胞内信号转导密切相关［2］。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)是90年代以来发现的最重要的生长信号调节蛋白，其成员细胞外信号调节激酶(extracellular signal－regulated kinases，ERKs)与细胞的增殖、分化有关［3］。本研究通过Western印迹方法测定正常卵巢组织、良性卵巢组织以及卵巢上皮癌组织中的ERK活性形式即磷酸化ERK(phosphorylated ERK，p－ERK)含量，并收集卵巢上皮癌患者的临床资料，包括患者的年龄、手术术后的残余灶、分期、分化、化疗的疗程、病理分型和生存时间，探讨卵巢上皮癌中p－ERK的表达及其与肿瘤患者预后之间的相互关系。

材料和方法

1 材料

收集浙江医科大学附属妇产科医院2001年1月～2008年12月符合本实验要求患者共计142例。

所有组织置于液氮中快速冰冻，然后保存于－80℃冰箱中。

正常卵巢组:35例，年龄41～62岁(中位年龄51岁);良性卵巢组:35例(浆液性囊腺瘤20例、黏液性囊腺瘤15例)，年龄39～61岁(中位年龄50岁);卵巢上皮癌组:72例，年龄33～70岁(中位年龄52 岁)。组织学分级:G1，13 例;G2，26 例;G3，33例。临床分期:I～II期21例，Ⅲ～Ⅳ期51例。病理类型:浆液性卵巢癌39例，未分化腺癌17例，黏液性卵巢癌6例，卵巢子宫内膜样癌10例。所有组织均经浙江医科大学附属妇产科医院病理科证实。卵巢上皮癌均为原发性卵巢肿瘤，术前无任何治疗，术后均采用以铂类为基础的联合化疗，其中疗程大于或等于6个的有53例，小于6个的有19例。残余灶直径大于2 cm的有26例，小于2 cm的有46例。

自手术之日起为随访开始时间，收集卵巢上皮癌患者的年龄、FIGO分期、病理分级、术后残余灶、化疗的疗程、病理类型以及生存时间，生存时间随访至2010年12月，纳入实验要求的卵巢癌患者均可随访。

2 主要试剂

小鼠抗大鼠p－ERK单克隆抗体(SC－7383)、化学发光试剂(sc－2048)购自Santa Cruz，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(ZB－2305)购自北京中山生物技术有限公司，辣根过氧化物酶标记单克隆小鼠抗甘油醛－3－磷酸脱氢酶(GAPDH)购自上海康成生物工程有限公司，苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、抑肽酶(aprotinin)和亮肽素(leupeptin)购自Sigma，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购自 Amersham，其余试剂均购自上海生物工程公司。

3 方法

3.1 样品的获取 切下约0.5 g新鲜冻存组织，剪碎后加入5倍体积的裂解液，其组成为:Tris－HCl 50 mmol·L－1(pH 8.0)，NaCl 150 mmol·L－1，乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetra－aceticacid，EDTA)0.5 mmol· L－1，二硫苏糖醇 (dithiothreitol，DTT)1 mmol·L－1，NP －401%，脱氧胆酸钠 0.5%，十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)0.1%，钒酸钠100 μmol·L－1，PMSF 100 mg·L－1，抑肽酶 1 mg·L－1，亮肽素 2 mg·L－1，冰浴条件下进行组织匀浆，4℃、12000×g离心10 min，取上清，用Folin酚法进行蛋白定量后保存于－70℃。

3.2 Western blotting检测p－ERK蛋白表达 取40 μg蛋白，加入上样缓冲液煮沸3 min变性后按文献报道的Western blotting方法［4］，完成十二烷基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS－PAGE)和蛋白转膜操作，膜片与I抗(小鼠抗大鼠p－ERK单克隆抗体，稀释浓度为1∶1000)进行抗原抗体结合反应，再与辣根过氧化物酶标记II抗(山羊抗鼠IgG，稀释浓度为1∶10000)反应，经适当洗涤，膜片与ECL温浴1 min，保鲜膜包裹后，经X光片曝光、显影和定影。为平衡所用蛋白量，所有PVDF膜均经洗脱后用辣根过氧化物酶结合的GAPDH抗体检测GAPDH的表达。应用Bio－Rad显影仪和相应图像分析软件程序光密度法定量检测p－ERK和GAPDH蛋白信号。以p－ERK和相应GAPDH蛋白信号的比值表示p－ERK的相对表达量。

4 统计学处理

用SPSS 16.0统计软件进行分析。生存时间指从手术之日至任何原因所致的死亡时间。p－ERK水平采用均数±标准差()表示，生存时间采用中位数表示。多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，生存曲线绘制用Kaplan－Meier法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 卵巢组织中p－ERK水平比较

分别测定正常卵巢组织、良性卵巢组织、I～II期卵巢上皮癌组织、Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌组织中p－ERK含量。在正常卵巢组织和良性卵巢组织中p－ERK含量较低，两者无明显差异(P＞0.05)，I～II期卵巢上皮癌组织和Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌组织中p－ERK含量较高，与正常卵巢组织p－ERK含量相比，差异显著(P＜0.01)，而且Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌组织中p－ERK含量明显高于I～II期卵巢上皮癌，两者相比有明显差异(P＜0.01)，见图1。

Figure 1.Expression of p－ERK in ovarian tissues from different groups..＊＊P＜0.01 vs normal.图1 不同组别卵巢组织中p－ERK表达水平

2 不同病理分化卵巢上皮癌组织中p－ERK水平比较

在不同病理分化的卵巢上皮癌组织中，低分化卵巢上皮癌组织中p－ERK含量最高，高分化卵巢上皮癌组织中p－ERK含量最低，两两相比，均有显著差异(P＜0.05)，见图2。

3 不同病理类型卵巢上皮癌组织中p－ERK水平比较

不同病理类型卵巢上皮癌中，p－ERK水平不同。与浆液性卵巢上皮癌组织相比，腺癌组织中p－ERK含量与其相仿(P＞0.05)，而黏液性卵巢上皮癌、卵巢宫内膜样癌组织中p－ERK含量较低(P＜0.05)，见图3。

Figure 2.Changes of p－ERK in ovarian cancer tissues with different pathological grades.G1:poorly － differentiated;G2:moderately－differentiated;G3:well－differentiated..*P＜0.05 vs G1.图2 不同病理分化卵巢上皮癌组织中p－ERK的表达水平

Figure 3.Changes of p－ERK in ovarian cancer tissues with different pathological types.Lane 1:serous carcinoma of ovary(n=39);Lane 2:adenocarcinoma(n=17);Lane 3:endometrioid carcinoma of ovary(n=10);Lane 4:mucinous carcinoma of ovary(n=6)..*P ＜0.05vs serous carcinoma of ovary.图3 不同病理类型卵巢上皮癌组织中p－ERK水平比较

4 卵巢上皮癌组织中p－ERK水平与生存时间的关系

根据p－ERK水平，将卵巢上皮癌患者分成3组，p－ERK ＜1.0组13例，1.0＜p－ERK ＜1.6组34例，p－ERK ＞1.6组25例。p－ERK ＜1.0组中位生存时间 60.0月(95%可信区间 53.4～66.6月);1.0＜p－ERK ＜1.6组中位生存时间 50.0月(95%可信区间38.1～61.9月);p－ERK＞1.6组中位生存时间 28.0月(95%可信区间 19.8～36.2月)。p－ERK水平越高的，生存时间越短，两者呈负相关。两两相比，均有明显差异(P＜0.01)，见图4。

Figure 4.The correlation between p－ERK expression level in ovarian cancer tissues and survival time(n=72).图4 卵巢上皮癌组织中p－ERK水平与生存时间的关系

5 多因素与生存时间的关系

采用多因素变量Cox回归分析多因素与生存时间的关系，见图5、表1。

Figure 5.Total survival curve(n=72).图5 总的生存率曲线

表1 卵巢癌患者Cox比例风险模型多因素回归分析结果Table 1.Multivariable Cox proportional hazards regression analysis of patients with ovarian cancer(n=72)

从表1可以看出，p－ERK含量、残余灶、肿瘤分期、肿瘤分级以及化疗疗程均P＜0.05，说明卵巢上皮癌患者的生存时间与p－ERK含量、残余灶、肿瘤分期、肿瘤分级以及化疗疗程有着密切关系。p－ERK含量越低，患者生存时间越长。而年龄、病理类型P＞0.05，无统计学意义，说明卵巢上皮癌患者的生存时间与患者的年龄、肿瘤的病理类型没有相关性。

讨 论

近年来，卵巢癌的发病率逐年上升，却缺乏有效的诊断和治疗方法，发现时多属于晚期，手术、化疗效果不佳。因此，研究导致卵巢上皮癌发生的分子发病机制，为卵巢癌的早期诊断和有效治疗提供理论依据是十分重要的。

体外及动物实验提示，ERK的激活与结肠癌、乳腺癌和前列腺癌等有关［5－6］，提示这一转导通路的异常可能与肿瘤的发生、发展、转移、预后有关。ERK在卵巢上皮癌组织中有过高表达［7］，促性腺激素诱导卵巢肿瘤细胞迁移和增殖需要ERK激活［8］，ERK可被顺铂、紫杉醇、内皮素1和促性腺激素释放激素激活并调节［9－10］，这些均提示ERK信号转导途径在调节外界刺激对卵巢癌的细胞增殖、存活和凋亡方面有很重要的作用。但对于p－ERK含量与肿瘤分期、肿瘤分级以及病理类型是否有关尚不明确，p－ERK与生存时间的研究未见报道。

我们的实验表明p－ERK在卵巢上皮癌中有过高表达，并且与卵巢上皮癌的分期、病理类型、病理分级有关。卵巢上皮癌组织中p－ERK含量明显高于良性卵巢组织和正常卵巢组织，Ⅲ～Ⅳ期卵巢上皮癌组织中p－ERK含量明显高于I～II期，良性卵巢组织中p－ERK含量与正常卵巢组织无显著差异;低分化卵巢上皮癌组织中的p－ERK含量高于中、高分化。在不同病理类型卵巢癌中，与浆液性卵巢上皮癌组织相比，腺癌组织中p－ERK含量与其相仿，而黏液性卵巢上皮癌、卵巢宫内膜样癌组织p－ERK含量较低。不同临床病理因素间p－ERK表达不同，其机制尚不明确。我们推测卵巢上皮癌，ERK信号途径被某种因素刺激，参与了卵巢上皮癌细胞的增殖和分化，p－ERK表达随着卵巢癌病程进展而增强。

迄今为止，仍未发现一种良好的预测卵巢上皮癌预后的生物学标志物［11］。晚期卵巢上皮癌的预后较差与多种因素有关。一般说来FIGO分期越晚、分化越低、术后残余灶＞2 cm、疗程越短，卵巢上皮癌的预后相对更差。在我们的实验中，卵巢上皮癌患者的生存时间与p－ERK含量、残余灶、肿瘤分期、肿瘤分级以及化疗的疗程有着密切关系，而肿瘤的病理类型没有相关性。提示p－ERK含量在判断卵巢上皮癌预后有着重要意义。

上述研究显示:p－ERK含量在卵巢上皮癌中表达过高，可能是卵巢上皮癌发病机制一个重要的调节激酶，测定p－ERK水平可能对卵巢上皮癌患者预后有预测价值。

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