Ezrin蛋白在宫颈脱落细胞中的表达研究及其与HPV16/18感染的相关性

张 帆 杨可达

1.中南大学湘雅医院妇产科，湖南长沙 410008；2.中南大学湘雅医院皮肤科，湖南长沙 410008

宫颈癌是妇科临床上较为常见的恶性肿瘤之一，近年来临床发病率呈现上升及年轻化的趋势，由于该病患者病死率较高，严重威胁了广大女性的健康[1]。最新研究表明，埃兹蛋白（Ezrin）)是恶性肿瘤的发展、浸润和转移过程中的关键调节因子，其主要是通过调节黏附分子及信号传导等途径实现的[2]。本研究对Ezrin蛋白的表达与宫颈癌关系及其与人乳头瘤病毒（HPV）感染的相关性作进一步探讨，旨在为Ezrin蛋白的临床辅助作用奠定分子生物学基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2009年10月—2011年12月期间，我院妇科进行手术治疗的宫颈癌患者113例，年龄42～65岁之间，平均年龄（54.62±12.81）岁。依据宫颈细胞病理学诊断报告（TBS）分类系统，其中19例为不能明确意义的不典型鳞状上皮细胞（ASC－US）；14例为低度鳞状上皮内病变（LSIL），均经病理切片诊断为CINⅠ；49例为高度鳞状上皮内病变（HSIL），经病理切片诊断为CINⅡ～Ⅲ；以及31宫颈鳞状细胞癌（CSCC）患者，经病理切片确诊为鳞状细胞癌。

1.2 研究方法

1.2.1 样本的处理 采用宫颈刷收集患者的宫颈脱落细胞样本，用4%甲醛溶液固定48h后，常规石蜡包埋，连续切片，对Ezrin蛋白进行免疫组化SP法检测。剩余细胞进行消化处理：50 mmol/L Tris，pH8.0；1 mol/L EDTA，pH8.0；0.5% 吐 温－20，0.2μg/μL 蛋 白酶 K，ddH2O；55℃水浴 2～3 h后离心，浓缩至 20 μL后可作为DNA模板进行HPV16/18的检测。

1.2.2 免疫组织化学检测Ezrin蛋白 采用免疫组化SP法检测Ezrin蛋白的表达情况，具体步骤严格按照说明书进行。阳性对照采用已知阳性片，阴性对照采用PBS代替第一抗体。阳性结果判定标准[3]：分别采用低倍和高倍镜观察全片，Ezrin阳性染色为细胞膜或细胞浆内出现棕黄色颗粒。在相同放大倍数(×400)下随机选取切片的5个视野，并随机计数100个细胞，当阳性细胞数＜5%时为阴性(－)，当阳性细胞数≥5%为阳性(＋)。

1.2.3 多重引物PCR技术检测HPV16/18 HPV16的特异性引物选择E6、E7基因区，扩增长度395 bp；HPV18的特异性引物选择L1基因区，扩增长度116 bp。PCR扩增条件为：94℃预变性8～10 min，94 ℃变性 30 s，53～55℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，32 个循环。PCR产物采用2%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察，395bp及116bp为阳性条带。

1.3 统计方法

采用SPSS 12.0软件进行统计分析，阳性率对比分析采用χ2检验，采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ezrin蛋白及HPV16/18在宫颈脱落细胞中的表达

与 ASC－US患者相比，LSIL、HSIL以及 CSCC患者 Ezrin蛋白及HPV16/18 DNA表达的阳性率明显提高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），结果见表 1。

表1 Ezrin蛋白及HPV16/18在宫颈脱落细胞中的表达

2.2 Ezrin蛋白与HPV16/18DNA表达的相关性

Ezrin蛋白与HPV16/18 DNA表达，经Spearman等级相关性分析，二者呈现正相关（rs＝0.768,P＜0.05）。

3 讨论

宫颈癌是由HPV病毒直接通过皮肤接触而传播的恶性肿瘤，已有研究证明，在宫颈癌的发病初期患者几乎是没有任何临床症状的，当病情发展到一定阶段后才会出现异常阴道流血现象[4]。同时HPV病毒感染与宫颈上皮瘤样变的发生密切相关，但其并不是细恶性转化的唯一因素，需要其他致病因素的共同存在。埃兹蛋白(Ezrin)作为膜细胞骨架连接蛋白，属于ERM(Ezrin、Radixin、Moesin)成员之一，其能够参与细胞与细胞、细胞与基质之间的作用，在肿瘤发展、浸润和转移过程中发挥了重要作用[5]。

本研究结果表明，与ASC－US患者相比，LSIL、HSIL以及CSCC患者Ezrin蛋白及HPV16/18 DNA表达的阳性率明显提高，差异均具有统计学意义（P＜0.05），且二者呈正相关。由此可见，Ezrin蛋白早期宫颈癌的筛查具有重要意义，有一定的临床应用价值。

[1]曹翠明,周亚滨,张丽.实时荧光定量PCR反应检测宫颈脱落细胞人乳头瘤病毒16/18型和巨细胞病毒的协同作用[J].医学检验与临床,2006,17(5):7－8.

[2]Khanna C,Wan XL,Bose S,et al.The membrane－cytoskeleton linker ezrin is necessary for osteosarcoma metastasis[J].Nat Med,2004,10(2):182－186.

[3]王秋兰.宫颈癌中Ezrin和Survivin的表达及其与浸润和转移的关系[J].中国妇幼保健,2010,25(10):1405－1407.

[4]申鹏,苏宁,陈斌,等.埃兹蛋白表达与肝细胞癌增值及转移的关系研究[J].解放军医学杂志,2009,34(6):737－739.

[5]徐飞,吴强,孙志华,等.宫颈癌中Ezrin和CD44－V6的表达及其相关性[J].江苏医药,2010,36(21):2494－2496.