黑曲霉固体发酵条件的优化

杨晓兰 任翠娟 易 卿 刘晓东 赵 洁

1.河南省农业微生物工程技术研究中心，河南 三门峡 472143；2.三门峡龙飞生物工程有限公司，河南 三门峡 472143

黑曲霉属子囊菌亚门丝孢目丛梗孢科，壁厚而光滑，顶部形成球形顶囊，其上覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状体（直径2.5～4.0μm）；分生孢子头呈球状，直径700～800μm，褐黑色；蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至呈黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色；分生孢子头呈褐黑色、放射状，分生孢子梗长短不一；顶囊球形，双层小梗；分生孢子为褐色、球形。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，是重要的发酵工业菌种。

利用微生物或生物产品来降解污染物的生物修复方法是目前消除和降解农药残留的一种安全、有效、廉价的方法，与传统的物理和化学方法相比，具有无毒、无残留、无二次污染等优点。微生物主要通过其特有的有机磷农药降解酶将有机磷农药中的P－O、P－S、P－N等化学键裂解而实现对有机磷农药的分解和利用。一种农药可以被多种微生物降解；同时，一种微生物也可以分解多种有机磷农药。赵杰宏［1］研究表明，有机磷水解酶（OPH）能够自发代谢有机磷农药，OPH能够广泛降解有机磷酸酯类组分的P－O、P－S、P－F和P－CN键，如对氧磷、对硫磷、甲基对硫磷、苯硫磷、毒死蜱、杀螟腈等。

近年来，国内外学者通过富集培养、分离筛选等技术，从土壤或污水中筛选出很多能够降解有机磷农药的菌群，包括细菌、真菌、放线菌、藻类等，其中以芽孢杆菌、苍白杆菌、克雷伯氏菌等细菌为主，对有降解有机磷农药能力的真菌也有报道，但多以曲霉属为主。由于真菌的生物量大，遗传性状稳定，而且产孢子的真菌在自然条件下具有较强的生存能力，因此筛选具有高效降解多种有机磷农药的真菌的研究已成为当前的研究重点和热点。王继雯等［2］从有机磷农药污染严重的土壤中分离获得了一株高效黑曲霉降解菌，对其降解酶进行了分离和纯化，并对其酶学性进行了研究，以期为筛选具有高效降解多种有机磷农药的微生物的研究提供理论依据。黄福常等［3］对灭菌的黑曲霉发酵滤液杀线虫作用进行了研究，找到了经济有效的发酵滤液培养基（豆芽汁培养基），发现不同浓度、不同pH值的发酵滤液均能影响其杀线虫效果。

黑曲霉菌渣的资源化利用研究吸引了越来越多的研究者。如何灏彦等［4］利用黑曲霉菌丝体制备壳聚糖；孟雪娇等［5］的研究结果表明，黑曲霉死菌粉剂所具有的多层纤维结构可为吸附染料分子提供较大的比表面，对于直接耐晒翠蓝染料的吸附处理，黑曲霉死菌粉剂与活性炭粉剂适宜的吸附条件为：酸性至弱碱性条件下，投加量为8g／L，黑曲霉死菌粉剂比活性炭粉剂的吸附速度快、脱色性能高、抗染料浓度负荷冲击能力强。黑曲霉菌体残渣资源化利用在技术领域具备可行的实践途径和案例，不仅能减轻环境污染，而且可实现变废为宝，但高值化开发黑曲霉菌体残渣仍有待进一步研究探讨。黑曲霉菌体残渣作为饲料添加物利用方面，一些有害的有机物成分还有待进一步检测［6］。

1 材料与方法

1.1 菌 种

黑曲霉斜面试管，4℃冰箱保藏，由河南省农业微生物工程技术研究中心保存。

1.2 仪器与器皿

试管，500mL三角瓶，250mL三角瓶，150mL三角瓶，高压蒸汽灭菌锅，万级无菌室，摇床，吸量管，平皿，培养箱。

1.3 菌种的处理

察氏培养基的制备：硝酸钠3g、磷酸氢二钾1g、硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g、氯化钾0.5g、硫酸亚铁0.01g、蔗糖30g、蒸馏水1 000mL，加热溶解，分装到500mL的三角瓶中，每瓶装200mL，121℃高压蒸汽灭菌30min，晾至35℃待用。

发酵培养基：固体培养基①包括麸皮70.0%、黄豆粉25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%和硫酸镁0.1%；固体培养基②包括麸皮70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%和硫酸镁0.1%；固体培养基③包括麸皮70.0%、米糠25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%和硫酸镁0.1%；固体培养基④包括米糠70.0%、黄豆粉25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%和硫酸镁0.1%；固体培养基⑤包括米糠70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%和硫酸镁0.1%；固体培养基⑥包括米糠70.0%、麸皮25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%和硫酸镁0.1%。

菌种活化：先将黑曲霉的试管种纯化后再用于试验。将一支黑曲霉斜面接种到已灭过菌的装有200mL察氏培养基的500mL三角瓶中，在摇床中于30℃、200r／min培养2～3d。

固体培养基①的处理：先将干的麸皮和黄豆粉按比例混合均匀，再将其他材料溶于800mL自来水中；用固体培养基①中的自来水拌湿拌匀麸皮黄豆粉；将混匀的物料于121℃灭菌60min，灭菌后物料含水量应在55%～60%；待温度降至接种温度后，将培养好的黑曲霉液体种子（约60mL）接种到固体物料上，并搅拌均匀。

其他固体培养基的处理同上。

1.4 发酵条件

固体发酵：要求在空气流通、温度25～34℃的水泥地面（消毒液浸泡过）上，将处理好的固体培养基铺成约2cm厚（平铺时宜使物料保持蓬松状态，不可拍打压实），用报纸将物料覆盖，发酵5～6d（发酵过程中不必翻搅），待黑色的菌丝或孢子囊大量形成时即发酵完成。

1.5 测定方法

采用稀释平板菌落计数法，具体操作方法：黑曲霉长成以后，晾干、粉碎，称取10g，放于装有100 mL无菌水（高压蒸汽灭菌）的225mL高压蒸汽灭菌的三角瓶中，静置20min，摇床摇30min；用5mL高压蒸汽灭菌的吸量管吸取1∶10稀释液5mL，沿管壁徐徐注入含有45mL无菌水的三角瓶内，振摇三角瓶混合均匀，制成1∶100的稀释液；另取5mL高压蒸汽灭菌的吸量管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释1次即换用1支5mL高压蒸汽灭菌的吸量管；稀释至合适倍数，取高压蒸汽灭菌的0.1mL吸量管吸0.1mL，注入装有固体培养基的平皿中，作3个平行样品，放入培养箱培养；培养24h后，计数。

2 结果与分析

黑曲霉不同固体发酵培养基菌活数及生长情况见表1。

表1 黑曲霉不同固体发酵培养基菌活数及生长情况

由表1可知，菌活数从大到小排列为：固体培养基②＞固体培养基⑤＞固体培养基①＞固体培养基③＝固体培养基⑥＞固体培养基④。研究表明，在固体培养基②的发酵条件下，黑曲霉菌活数最大，固体培养基⑤次之。固体培养基④和固体培养基⑤染有杂菌因此都显灰色，且固体培养基④染菌较固体培养基⑤严重；以麸皮作主料，黄豆粉、玉米粉与米糠3者相比，玉米粉影响最大；以米糠作主料，黄豆粉、玉米粉与麸皮3者相比，玉米粉影响最大。

3 讨 论

以黑曲霉为研究对象，经不同固体培养基发酵，以稀释平板菌落计数法检测黑曲霉的菌活数，测得菌活数从大到小排列为：固体培养基②＞固体培养基⑤＞固体培养基①＞固体培养基③＝固体培养基⑥＞固体培养基④。研究表明，在固体培养基②的发酵条件下，黑曲霉菌活数最大，固体培养基⑤次之。米糠与麸皮相比，麸皮作主要原料黑曲霉的菌活数更大；黄豆粉、玉米粉分别与米糠和麸皮相结合的各组合相比，玉米粉与麸皮的组合黑曲霉菌活数最大。麸皮较米糠粘性强、吸水性好、营养更丰富，所以作为黑曲霉发酵主料更合适。试验表明，黑曲霉的优化培养基是麸皮70.0%、玉米粉25.0%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸铵0.1%、碳酸钙0.1%、硫酸镁0.1%。

［1］赵杰宏.有机磷水解酶基因OPD转化番茄、黄瓜降解农药残留的研究［D］.贵阳：贵州大学，2010.

［2］王继雯，甄静，谢宝恩，等.黑曲霉有机磷农药降解酶的纯化及其性质［J］.江苏农业学报，2012，28（3）：549－554.

［3］黄福常，覃培升，韦春月.黑曲霉发酵滤液杀食用菌线虫活性初探［J］.广西农业生物科学，2008，27（4）：439－444.

［4］何灏彦，刘佳佳，于津津.利用黑曲霉菌丝体制备壳聚糖的研究［J］.粮油加工，2009（5）：127－129.

［5］孟雪娇，熊小京，黄艺海，等.黑曲霉死菌与活性炭对直接耐晒翠蓝FBL的吸附性能［J］.环境工程学报，2010，4（6）：1317－1320.

［6］陈秀龙，蔡冠杰，覃新导，等.黑曲霉菌渣资源化再利用途径分析［J］.热带农业科学，2011，31（6）：24－27.