肉牛大肠杆菌、志贺氏菌与牛支原体混合感染的诊断与分析

彭清洁 王 冲 胡长敏 陈颖钰 晁 金 闻晓敏 姜 鹏 郭爱珍 ，3，4**

1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学动物科技学院，武汉 430070；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070；4.国家肉牛产业技术体系疾病控制功能研究室，武汉 430070；5.武汉科前动物生物制品有限责任公司，武汉 430070；6.武汉海康尔牧业有限公司，武汉 430070；7.武汉市蔡甸区畜牧兽医局，武汉 430100

湖北天门某肉牛养殖场2012年4月初从长春营城子购入一批250kg左右的西杂牛，自购入15d左右肉牛开始发病，主要表现为咳嗽、流鼻涕、拉血便和血尿、呼吸急促、关节肿大、体温升高及精神沉郁。根据牛场主的介绍，结合相关文献报道资料，初步判定是长时间运输，导致犊牛遭受拥挤、饥渴、强噪音等一系列环境因素应激，致使犊牛发病。为确诊病因，本试验对病牛进行剖检取样、致病菌常规分离纯化、病原菌16sRNA鉴定和小鼠攻毒试验。对心脏和肾脏组织样品制作病理切片并观察，可见心肌充血、出血及心肌纤维细胞变性坏死，肾脏淤血、水肿、肾小管变性坏死。

1 材料与方法

1.1 样品

无菌采集病死牛心、肝、脾、肺和肾组织各1份。将采集的各脏器组织块放入10%的福尔马林溶液中固定（固定液的用量是采集组织病料的15倍），备用。

1.2 培养基

李斯特菌（LuriaBertani，LB）液体培养基：称量胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl10g，溶解于ddH2O中；待其完全溶解后，再用5mol/LNaOH调节pH值至7.0～7.2，定容至1000mL；然后高压蒸汽灭菌20min，室温保存，备用。

胰蛋白胨大豆肉汤（TrypticsoyBroth，TSB）培养基，批号1091999，美国碧迪医疗器械（上海）有限公司生产，按照说明配制，高温灭菌，备用。

胰蛋白胨大豆琼脂（TrypticSoyAgar，TSA）培养基，批号1074969，美国碧迪医疗器械（上海）有限公司生产，按照说明配制，高温灭菌，备用。

麦康凯琼脂培养基，批号120514，杭州天和微生物试剂有限公司生产，按照说明配制，高温灭菌，备用。

伊红美兰琼脂培养基，批号20110511-01，杭州微生物试剂有限公司生产，按照说明配制，高温灭菌，备用。

支原体（Pleuropneumonia-LikeOrganisms，PPLO）固体培养基及液体培养基用于牛支原体的分离培养，配制所用肉汤粉、琼脂粉等均由BD公司生产，参考文献资料进行配制，但未加1%醋酸铊溶液。TSA、TSB购自上海生工生物工程有限公司，麦康凯购自杭州天和微生物试剂有限公司。

水培酪蛋白（M-H）琼脂培养基，批号20110511，杭州微生物试剂有限公司生产。

1.3 药敏纸片

青霉素、强力霉素、环丙沙星、卡那霉素、克林霉素、恩诺沙星、头孢氨苄、林可霉素、庆大霉素、新霉素、阿奇霉素、链霉素、先锋必和红霉素13种常用药敏试纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司，批号为201108，-20℃密闭保存。

1.4 实验动物

6只SPF设雌性昆明鼠，3周龄，体重20～25g，购于湖北省疾控中心。购买后，给予充足的饲料和饮水，按照相关实验动物饲养规程进行饲养。5只小鼠随机分配，分别注射从病牛心、肝、脾、肺、肾得到的组织物培养菌液，另1只用于设置对照，注射等量生理盐水。

1.5 试验方法

1）细菌的分离与纯化。无菌操作，在无菌操作台上，用消毒后的接种环穿刺所采集的心、肝、脾、肺、肾典型病变处，将采集好的病料划线接种在TSA培养基、麦康凯琼脂培养基、伊红美兰琼脂培养基，置37℃恒温培养箱中培养24h。然后分别观察各培养基上生长菌落的颜色、形状和大小等情况。

2）细菌的PCR鉴定。采用设计的引物，以细菌DNA为模板，进行PCR扩增试验和鉴定。

①细菌DNA模板的制备。将分离纯化后的细菌菌株接种至TSB培养基中，37℃摇床过夜培养。取150μL过夜培养菌液，放入Eppendorf管中，煮沸 10min，冰浴 1min，12000r/min离心 30s，取上清液作为DNA模板。

②扩增。16SrRNA通用引物序列为；16Sr-RNA-forward:5'-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3'、16SrRNA-reverse:5'-CGCGGATCCGCrACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系为50μL， 其 中 2×Taq Mixture（Tiangen）2.5μL，Primers（10μmol/L）各 2.0μL，DNA 模板 7.5μL，去离子水13.5μL。

PCR反应程序如下：94℃预变性 10min后，94℃变 性 1min，55℃10min 退火 1min，72℃延 伸1min，30 个循环后，72℃延伸 10min。

3）牛支原体的分离与鉴定。无菌取小块的肺组织样品，涂于PPLO固体培养基表面，于含5%的CO2培养箱中培养，同时将小块组织样品投入到PPLO液体培养基中，2～3d后，用光学显微镜低倍镜观察菌落形态，支原体在固体培养基上应具有“煎蛋样”特征，液体培养基由红色变黄色且透亮。

无菌操作，在无菌操作台上，用无菌牙签挑取牛支原体菌落于预加入150mL灭菌水的Eppendorf管中，煮沸 10min，冰浴 1min，12000r/min离心 30s，然后取上清液作为DNA模板。利用牛支原体特异性引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆至质粒pMD18-T（宝生物工程大连有限公司）中，委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行序列测定。

牛支原体的特异性引物如下：SCl:5'-ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG-3'、SC2:5'-CTGATTATGATGACAGTGGTCA-3'。

PCR反应体系为20μL，其中：2×TaqMixture（Tiangen）10μL，引物 SCl和 SC2（10μmol/L）各1.0μL，支原体DNA模板1.0μL，去离子水7.0μL。

表1 试验用抗生素的种类、药敏纸片含药量及抑菌圈直径判断标准

PCR反应程序：94℃预变性 5min，94℃变性45s，57℃退火 30s，72℃延伸 1min，35 个循环后，72℃延伸10min。PCR产物预期大小为277bp。

4）药敏试验。采用琼脂纸片扩散法（K-B法）进行药物敏感性试验。所用培养基为水解酪蛋白（M-H）琼脂培养基，所用的药敏纸片有青霉素G（10μg/片）、强力霉素（30μg/片）、环丙沙星（5μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、克林霉素（2μg/片）、恩诺沙星（5μg/片）、头孢氨苄（30μg/片）、林可霉素（2μg/片）、庆大霉素（10μg/片）、阿奇霉素（15μg/片）、新霉素(30μg/片)、先锋必（75μg/片）和红霉素（15μg/片）13种常用药敏试纸片。运用琼脂纸片扩散法来测定分离到的细菌菌株对所选用的抗菌药物试纸片药物的敏感性。判断标准见表1。

5）病理切片、HE染色。病料取样：主要取病变心脏组织，取几块相同大小的组织块，放入液氮管，-80℃保存；取肾脏组织用4℃ 4%中性多聚甲醛溶液固定。选取的组织材料，厚度2～4mm，面积1.5～3.0cm×2.0cm为宜，一方面利于组织块迅速固定，另一方面便于尽可能全面观察病变。常规HE染色：固定好后，脱水，透明，石蜡包埋，制备4μm厚切片，常规HE染色。观察并采图：在光学显微镜下观察所制作的切片并采图。

6）小鼠攻毒试验。待培养的细菌菌株活化以后以1∶1000的比例转接到盛有5mLTSB的细菌瓶中，37℃摇床中震荡培养至OD值达到2.7左右（约4h）时开始处理细菌。

先取1mL菌液于1.5mLEP管中，8000r/min离心4min，用生理盐水洗涤悬垂2次，之后转入到盛有9mL生理盐水的瓶中，再以1∶10的比例稀释，一共得到3个梯度的菌液。

5只3周龄雌性昆明鼠，取过夜菌液200μL，注射小鼠腹腔内，对照组小鼠注射等量的生理盐水。其中注射有肺部细菌（天门）培养液的小鼠24h内死亡，注射有气管内细菌（天门）培养液的小鼠48h内死亡。解剖致死的小鼠，分别取其心、肝、脾、肺、肾接种分菌，PCR鉴定。

2 结果与分析

2.1 临床鉴定结果

图1 病牛肺充血、出血、呈现肉变

图5 脾缩水、出现褶皱

图6 心脏充血、出血

根据病牛的临床症状及牛场主口述的情况来看，病牛很可能是由于长时间的长途运输使其产生应激，不适应新环境导致发病，初步诊断为运输应激综合征。临床上，病牛表现为咳嗽、流鼻涕、呼吸急促、关节肿大及精神沉郁。剖检可见牛肺充血、出血、呈现肉变，肺切面钝圆呈暗红色；支气管有明显白色泡状物；关节肿大；脾缩水、表皮皱缩；心脏充血、出血，心腔内有暗红色积血（如图1～6所示）。推测病牛有呼吸系统疾病。

2.2 细菌初步鉴定结果

在PPLO牛支原体专用培养基上，菌落生长良好，所有菌落呈典型的“油煎蛋状”；在麦康凯琼脂培养基上有红色菌落生成，形成圆形凸起，边缘整齐、光滑菌落，直径约2～3mm；在伊红美兰琼脂培养基上，有黑色带金属闪光的菌落。

2.3 药敏试验结果

药敏试验结果见表2。

表2 药敏试验结果 mm

由表2可知，从该病牛病变组织中分离得到的细菌和支原体对本试验中所用的常见药敏纸片的耐药性较严重；大肠杆菌、志贺氏菌仅对新霉素敏感，对其他抗生素不敏感；牛支原体对环丙沙星、恩诺沙星敏感，对其他抗生素不敏感。

2.4 PCR扩增鉴定结果

对16SrRNA扩增产物进行测序分析，用BLAST软件进行序列同源性比较。结果表明：“油煎蛋状”菌落为牛支原体，麦康凯琼脂培养基上生成的红色菌落为大肠杆菌；在伊红美兰琼脂培养基上黑色带金属闪光的菌落为志贺氏菌。

2.5 病理切片、HE染色结果

本试验将之前采集好的储存在10%福尔马林溶液中固定的病牛的心、肝、脾、肺和肾组织做了常规的石蜡切片，并且进行了HE染色，在光学显微镜下观察，结果显示病牛不同的组织器官有不同的病理变化，心、肾表现得尤为明显。其中，心肌充血、出血，心肌纤维细胞变性坏死；肾淤血、水肿、肾小管变性坏死。

图7 心肌病变组织的组织病理学观察（HE染色，400×）

图8 淤血、水肿、肾小管变性坏死（HE染色，400×）

图9 小鼠剖检病变组织病理变化

2.6 小鼠攻毒试验结果

小鼠攻毒试验表明：病牛肺组织细菌培养液的毒力最强，注射的小鼠24h内死亡，剖检可见肺充血、出血、肺泡内有少量浆液性渗出物；其次是气管细菌培养液，注射的小鼠48h内死亡，剖检可见小鼠肝淤血、肠绒毛膜损坏如图9所示。扑杀小鼠后，无菌采集心脏血进行细菌的分离和PCR鉴定，确认其与牛肺中分离到的大肠杆菌和志贺氏菌一致。因此可以确诊病牛发生了大肠杆菌和志贺氏菌的混合感染。

3 讨论

3.1 临床诊断

正常的运输也会产生许多应激，主要的应激源是供水不足、拥挤、微生物影响、饲料影响等，其他如运输前后饲养场地和环境变化、阉割、驱虫等一些处理办法，也会给牛造成应激，所有的这些应激都可能影响到牛对营养物质的需要。而环境、应激、营养3者之间又存在着一定的联系。所以必须考虑选择最大限度的发挥家畜生产性能的最合理的管理设施。

3.2 细菌鉴定

本试验对牛场主送检样品进行实验室检测，综合判断病牛为大肠杆菌、志贺氏菌与牛支原体混合感染。

牛大肠杆菌病是致病性大肠杆菌引起的、主要在新生犊牛中发生的急性传染病，其最主要特征表现为败血症和剧烈的腹泻，严重时可导致病牛脱水死亡。一般情况下，成年牛发病不致死。

目前，传染性牛支原体肺炎已被认为是育肥牛、犊牛等的呼吸道疾病与多发性关节炎的重要病因，同时，也是引发肉牛运输应激综合征的主要病因。牛支原体常与细菌、病毒等共同作用，再加上一些环境因子（如天气突变、通风不良、拥挤等），更会加剧病情。临床上用多种抗生素进行治疗，但效果不理想。该病例中，发病牛均为犊牛，且4月初刚从长春营城子运至湖北天门不久，北牛南运以及饲养条件改变等均可为支原体病的发生提供有利条件，而伴随的细菌混合感染，更加导致病情复杂化。

志贺氏菌是由志贺氏菌引起的一种传染病。志贺氏菌可以分成痢疾志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌、福氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌4个血清群（种）。其中痢疾志贺氏菌感染最为严重，宋内氏志贺氏菌引起的感染一般比较轻，福氏志贺氏菌容易转变成慢性感染。近几年发现，志贺氏菌不仅感染人，也可引起动物发病。目前，国内外已有关于志贺氏菌感染仔猪、幼犬、鸡、鸭、犊牛等多种动物的报道，从而引起动物大批发病、死亡，给养殖业造成很大的经济损失。本病例中犊牛排血便、血尿，有可能是志贺氏菌感染了犊牛的肠道系统。但志贺氏菌为什么、如何侵袭直肠、结肠黏膜的机理暂时还不清楚。有研究认为是直肠、结肠黏膜在志贺氏菌存在的条件下对急性水肿异常敏感而导致；但也有研究认为是因为志贺氏菌表达的是一个结肠特定的黏附系统。有待进一步研究。

3.3 大肠杆菌、志贺氏菌与牛支原体耐药性

药敏试验是研究药物抑制、杀灭细菌的机理以及指导临床用药的依据之一。细菌接触到抗生素以后，就处于生长和被抗生素抑制的竞争环境，故任何一个影响细菌生长分裂的因素都可以影响到抗生素对细菌的杀灭作用。抗生素可以启动细菌的凋亡机制，而细菌则可以通过包括基因突变在内的各种方式存活下来。

研究表明，从20世纪80年代到现在，志贺氏菌已对多种抗生素产生了耐药性。抗生素的大量、广泛使用是导致耐药性产生的原因之一，细菌暴露在抗生素中的时间越长，其获得耐药性的几率就越高。另有研究表明，志贺氏菌具有耐药产生速度快、耐药范围广等特点，对氨苄青霉素、氯霉素、链霉素等广谱抗菌素的多重耐药性逐年上升，对抗生素的耐药率逐年提高，多重耐药菌株的耐药谱也在逐年增加。本试验的研究表明，志贺氏菌对新霉素较敏感，临床上可用其治疗疾病。志贺氏菌对临床上常使用的环丙沙星等抗生素敏感性很差，故可表明这些抗生素对细菌性痢疾已无多大疗效，而青霉素、链霉素对菌痢的治疗不起任何作用。

药敏试验还表明，传统治疗大肠杆菌的药物（如庆大霉素、环丙沙星、头孢类药物）对分离到的菌群均具有敏感性，如果及时使用，能很好地控制疫情。但大肠杆菌病对常用的抗生素的敏感性越来越弱，因而耐药菌株日益增多。据文献资料，从各地的各种动物中分离到的大肠杆菌对抗生素的敏感性差异很大，目前也较难确定一个能普遍适用的抗菌药物敏感谱。临床建议治疗细菌性疾病的时候，最好选用经抗生素敏感试验确定为高度敏感的药物进行治疗，如此才能收到良好的治疗效果。另外，本试验表明支原体对环丙沙星、恩诺沙星敏感。另据文献报道，在不同牛场分离到的牛支原体对药物的敏感性有较大差异，故在临床使用时，也应进行药敏试验来确定治疗用药物。早期使用泰乐菌素类（替米考星）及泰妙菌素类（支原净）抗菌药，对犊牛支原体病有一定疗效。

3.4 临床建议

综合以上信息，该肉牛场的肉牛是混合感染了大肠杆菌、志贺氏菌与牛支原体而导致发病，根据以前报道的文献资料及本次药敏试验结果，给牛场主以下临床建议。

1）抗菌消炎。根据药敏试验结果，大肠杆菌、志贺氏菌对新霉素敏感，故可用新霉素制剂对发病牛群进行抗菌消炎。

2）对症治疗。对于发热的牛可用解热药，如安乃近、复方氨基比林；对于喘气严重的牛应用支气管扩张药，如氨茶碱；同时由于肺炎导致肺水肿，可给以利尿脱水药，如呋塞米，用量为0.5～1.0mg/kg体重，2次/d；对于体质弱的牛补充能量、维生素C和复合维生素B。

3）牛舍和运动场要严格消毒。另一方面，由于肉牛在长途运输过程中会受到不同程度的应激影响，运输到达目的地之后要重新适应新环境、饲料等，对生长非常不利。因此不建议从外地引进牛；如果可能，各牛场应按就近原则引进牛。如必须在外地引进，引进新牛群前，应对牛舍进行彻底地清洗、消毒，并对原有牛群进行免疫接种预防措施。新引进牛群在运输过程中应该给予合理的饲养管理及饮水，忌太拥挤，引进后，注意日粮的合理搭配。

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