菟丝子中总黄酮的闪式提取工艺及近红外透射光谱含量分析方法

2012-07-28杨天鸣付海燕付友珍常梦颖

化学与生物工程 2012年9期

杨天鸣,李纯,付海燕,付友珍,常梦颖,杨琛

(中南民族大学药学院，湖北武汉 430074)

菟丝子(Cuscutachinensis)为旋花科植物南方菟丝子(CuscutaaustralisR.Br.)或菟丝子(CuscutachinensisLam.)的干燥成熟种子[1]。具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等功效。菟丝子的主要活性成分为黄酮类化合物，其中以槲皮素、芦丁及山奈酚为主[2]，具有清除氧自由基、扩张血管、改善脑循环、抑制血小板活化因子(PAF)等作用，近年来对菟丝子的研究已成为热点。

目前提取中药黄酮类化合物的方法主要有：溶剂提取法[3]、微波提取法[4]、超声提取法[5]、半仿生提取法[6]、超临界流体萃取法[7]。测定黄酮类化合物含量的方法主要有：紫外分光光度法[8]、高效液相色谱法[9]、高效毛细管电泳法[10]、色谱-质谱联用法[7]、近红外光谱法[11]等。闪式提取器是一种用于植物材料快速提取的新型提取器，其原理是依靠高速的机械剪切力和搅拌力，使植物有效成分迅速溶解分散到提取溶剂中，具有高效、快速、不需加热、不破坏成分、适宜多种溶剂等优点。

作者在此采用闪式提取法对菟丝子中总黄酮进行提取，并建立近红外透射光谱定量分析模型对提取液中总黄酮含量进行直接测定。

1 实验

1.1 材料、试剂及仪器

菟丝子药材(产地四川，购自武汉德仁堂大药房)，经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定。

芦丁对照品，中国药品制品生物鉴定所；95%乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯，国药集团化学试剂公司。实验用水均为纯水。

JHBE-50A型闪式提取器，河南金鼐科技发展有限公司；UV-1100型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；Antaris Ⅱ型傅立叶变换近红外光谱仪，美国Thermo Nicolet公司；DFF-100型手提式高速中药粉碎机，温岭林大机械有限公司；DZF-6021型真空干燥箱，上海一恒科技仪器有限公司。

1.2 样品处理

将菟丝子用水洗净，置于真空干燥箱中真空干燥12 h，取出，粉碎，过60目筛，再次干燥12 h，置玻璃干燥器内，备用。

1.3 芦丁标准溶液的配制

准确称取芦丁对照品(60 ℃干燥至恒重) 0.0200 g于100 mL烧杯中，用30%乙醇溶解后转移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，配成质量浓度为0.200 mg·L-1的芦丁标准溶液。

1.4 菟丝子供试品溶液的配制

配制一定浓度的乙醇，按照一定的料液比(mg∶mL,下同)浸泡菟丝子粉末样品12 h。用闪式提取器采用间歇式方式提取浸泡样品，电压100～150 V，每次30 s，累计8 min。提取液静置1 h后,用布氏漏斗抽滤得澄清滤液，即得菟丝子供试品溶液。将其装入棕色广口瓶，置阴凉处备用。

1.5 芦丁标准曲线的绘制[3]

准确吸取芦丁标准溶液4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL，分别置于50 mL容量瓶中，用30%的乙醇适量稀释。加入1 mL 5% NaNO2溶液，摇匀，放置5 min；再加入1 mL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀，放置6 min；然后加入5 mL 1 mol·L-1的NaOH溶液，混匀，放置10 min后，用30%的乙醇稀释至刻度。以不加菟丝子供试品溶液的空白溶液为参比，用紫外分光光度计于371 nm处测定吸光度值。以芦丁浓度c(mg·mL-1)为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，如图1所示。拟合线性回归方程为y=11.21250x-0.00960，相关系数R=0.99999。

图1 芦丁标准曲线

1.6 近红外透射光谱测定方法[4]

分别吸取菟丝子供试品溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL转入到10 mL容量瓶中，用50%的乙醇稀释至刻度。将待测样品装入样品池，使用透射附件采集近红外光谱。采集条件：采集光谱范围4000～10 000 cm-1，扫描次数32次，分辨率8 cm-1。每个样品测定10次，每次测定采集3张图谱，取其平均光谱数据用于处理。采集的光谱数据用TQ Analyst智能分析软件处理和计算。同一样品溶液按照1.5紫外分光光度法测定总黄酮含量，用于近红外透射光谱定量分析建模。

2 结果与讨论

2.1 闪式提取工艺条件

不同闪式提取工艺条件下所得菟丝子供试品溶液的总黄酮含量测定结果见表1。

表1 不同闪式提取工艺条件下菟丝子供试品溶液的总黄酮含量测定结果

由表1可知，当提取溶剂为50%的乙醇、料液比为1∶8时，供试品溶液的总黄酮含量最高。在此最优提取工艺条件下，平行提取3组供试品溶液，总黄酮含量平均为0.0200 mg·mL-1，标准偏差为0.2%。表明闪式提取法的提取稳定性比较好，在一定条件下提取液中总黄酮含量仅与提取溶剂浓度及料液比有关。

2.2 近红外透射光谱定量分析模型的建立

2.2.1 菟丝子供试品溶液的近红外透射光谱图

采集不同总黄酮含量的菟丝子供试品溶液的近红外光谱，结果见图2。

1～7,总黄酮含量(mL):3,4,5,6,7,8,9

2.2.2 定量分析光谱波段选择

黄酮的近红外透射光谱吸收峰大约在5800 cm-1处，而水的吸收峰在5100 cm-1和6800 cm-1两处，因而必须选择合适的波段进行分析才有效。通过全谱区段的考察发现，5750～5986 cm-1范围的信息量丰富，选取此波长区间进行数据处理建立的定量数学模型交叉验证标准差(RMSECV)小，定量分析结果较好。因此，菟丝子供试品溶液的定量分析模型波段选择如图3所示。

图3 菟丝子供试品溶液的近红外光谱定量预测模型波段选择

2.2.3 主成分分析

主成分分析是用数目较少的新变量成分代替原变量，而且新变量最大限度地表征原变量的数据结构特征，同时去除无用信息。通过主成分变换可有效地将数据降维，以消除众多信息共存中相互重叠的部分。在5750～5986 cm-1信息丰富的范围内提取近红外透射光谱的主成分，考察预测残差平方和(Predictive residual error sum of square，PRESS)与主成分数间的关系，结果见图4。由最小PRESS 确定最佳主成分数为2。

图4 PRESS与主成分数关系

2.2.4 偏最小二乘法(PLS)回归分析

菟丝子供试品溶液总黄酮含量的定量预测模型是通过PLS回归(主成分数为2)和交叉验证来实现。用PLS回归建立模型时，在135个样本中随机选择45个样本作为验证集(Validation),其余90个样本作为校准集(Calibration)，用相关系数R、校正标准差(RMSEC)、预测标准差(RMSEP)来评价校准集，通过交叉验证标准差(RMSECV)和相关系数R来评价验证集。

菟丝子供试品溶液的PLS回归分析结果见图5。

图5 PLS回归分析结果

一个好的模型应该具有较小的RMSEC、RMSEP及较高的相关系数，本实验所建立模型的相关系数为0.99985、RMSEC为0.0685、RMSEP为0.160，表明模型具有相当好的线性以及预测能力。模型的交叉验证结果见图6。

图6 交叉验证结果

由图6可知，交叉验证结果的相关系数为0.99966，交叉验证标准差(RMSECV)为0.102。表明模型具有良好的稳定性。

2.3 近红外透射光谱定量分析模型评价

分别精密吸取菟丝子供试品溶液4.5 mL、5.5 mL、6.5 mL、7.5 mL转入10 mL的容量瓶中，用50%的乙醇定容至刻度。按照1.6方法进行近红外透射光谱扫描。将数据代入菟丝子供试品溶液的总黄酮含量定量预测模型进行计算，所得结果与紫外分光光度法测定结果相比较，如表2所示。

表2 总黄酮含量测定结果比较/μg·mL-1

由表2可知，近红外透射光谱偏最小二乘法模型与紫外分光光度法测量的总黄酮含量相差很小。

3 结论

用闪式提取法提取菟丝子中的总黄酮，确定最佳提取工艺条件为：料液比1∶8(mg∶mL)，以50%的乙醇为溶剂提取8 min。用PCA结合PLS法建立近红外透射光谱定量数学模型对提取液中总黄酮含量进行分析，所建立模型具有较好的线性关系，RMSEC、RMSEP以及RMSECV值均较小，分别为0.0685、0.160、0.102。利用该模型预测和紫外分光光度法测量的总黄酮含量相差很小。表明近红外透射光谱结合PLS回归是一种快速、简便、无损、稳定的定量分析方法，适用于中药提取过程的在线检测和质量控制分析。

参考文献：

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