炼厂油泥降解菌的筛选及降油条件初探

梁利华，董 霞

(石药集团维生药业(石家庄)有限公司，河北 石家庄 050035)

石油炼厂污水处理系统和石油储运系统会产生大量的炼油污泥(简称油泥)。常见的生物处理方法有：土地耕作法[1]和生物堆肥法[2]。温度、油本身的组分、外源营养物质、油污的物理状态等是影响微生物降解能力的主要因素[3]。不同微生物对原油中烃类化合物的代谢途径和机理不同，目前对原油烃的微生物降解研究多为以下3个方面：筛选和驯化优良降解菌种[4，5]；原油降解特性的研究[6]；微生物治理原油污染的应用研究[7]。作者筛选出高效稳定降解油泥的菌株，优化其实验室培养条件，初步探讨了该菌在实验室条件下处理炼厂油泥的效果，为其进一步应用奠定基础。

1 实验

1.1 材料与培养基

实验用土样采自钻井机周边土壤和某炼厂厂内土壤，泥样采自某炼厂污水处理站活性污泥、污水处理站处理后污泥。

(1)基础无机盐溶液(g)：NaCl 0.5，(NH4)2SO40.1，NaNO30.2，KH2PO40.4，K2HPO4·3H2O 1.0，蒸馏水 100 mL。

(2)原油液体培养基：基础无机盐溶液100 mL，原油(胜利原油，下同)2.0 g，pH值自然。

(3)原油固体选择性培养基：基础无机盐溶液 100 mL，原油2.0 g，酵母膏0.1 g，琼脂1.5 g，pH值自然。

(4)葡萄糖液体培养基：基础无机盐溶液100 mL，酵母膏0.1 g，20%葡萄糖溶液5.0 mL，pH值自然。

(5)LB液体培养基。

(6)油泥培养基：油泥5.0 g，优化的无机盐溶液50.0 mL，pH值自然。

1.2 菌株筛选

1.2.1 初筛

将采集到的样品加入到原油液体培养基中，在30 ℃、160 r·min-1下摇床培养7 d。取降解现象明显的培养基，在原油固体选择性培养基上进行划线分离，30 ℃下培养4～5 d。从降油斑附近挑取单菌落到葡萄糖液体培养基中，摇床培养24 h,再次划线，分离保存。

1.2.2 复筛

将初筛得到的菌株接种到葡萄糖液体培养基中，160 r·min-1、30 ℃下培养24 h。吸取10 mL菌液加入到原油液体培养基中，30 ℃、160 r·min-1下培养7 d。用紫外分光光度法测其含油量。将筛选出的高效降油菌株接种到LB液体培养基中，30 ℃、160 r·min-1下培养，用分光光度法测定菌体生长量。

1.2.3 菌株生理生化特性

对所筛选出的菌株进行革兰氏染色、淀粉水解、明胶液化、糖或醇发酵、甲基红(MR)、乙酰甲基醇(VP)、吲哚、硫化氢产生等生理生化实验。

1.3 温度、pH值、葡萄糖及无机盐浓度对降解菌T1生长的影响

将经LB液体培养基培养后的菌株T1，按5%的接种量接种到121 ℃灭菌20 min的葡萄糖液体培养基培养20 h，测量菌体生长的OD600值。考察温度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、pH值(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、葡萄糖浓度(g·L-1)(10、15、20、25、30)、无机盐浓度(g·L-1)[NaCl为1.0、3.0、5.0、7.0、9.0；(NH4)2SO4为0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8；NaNO3为1.0、1.5、2.0、3.0、4.0；KH2PO4为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0；K2HPO4·3H2O为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0]对菌株生长的影响。

1.4 无机盐对菌株T1降解油泥的影响

1.5 降解菌对油泥的降解效果

在油泥培养基中考察筛选菌株对油泥的降解效果。

2 结果与讨论

2.1 菌株分离纯化

分离得到纯化菌株8株，其中4株原油降解率在60%以下；3株原油降解率在60%～70%之间；1株原油降解率在70%以上。图1为3株原油降解率较高菌(T1、A2、Z8)的降解效果，其中菌株T1对原油的降解效果最好，降解率为17.9%。

图1 筛选的3株菌对原油的降解率

2.2 菌株生理生化特性(表1)

从表1可知，根据菌株形态及生理生化特征，初步鉴定菌株T1为芽孢杆菌属。

2.3 降解菌T1的生长曲线

选定降油效果最好的菌株T1测定其生长曲线，结果见图2。

从图2可以看出，在0～16 h期间，菌株大量繁殖，处于对数生长期；在16～42 h期间，生长量变化不大，处于稳定期；在42 h之后，生长量减少，菌体生长进入衰亡期。因此，选择菌液的发酵时间为20 h。

表1 菌株初步鉴定结果

图2 菌株T1的生长曲线

2.4 温度、pH值、葡萄糖及无机盐浓度对降解菌T1生长的影响(图3、图4)

图3 温度、pH值、葡萄糖浓度对T1生长的影响

图4 无机盐浓度对T1生长的影响

对图3进行分析，发现温度和pH值对菌株T1生长的影响较大，这一结论和其它降油菌的研究相似[8]。

对图4进行分析，各无机盐中，K2HPO4·3H2O对菌株生长影响最大，K2HPO4在补充磷源的同时使培养基的pH值缓冲在偏碱性条件，有利于菌株的生长。得到降解菌T1的最佳培养条件及培养基组成为：温度30 ℃，pH值9.0，葡萄糖25 g·L-1，NaCl 3.0 g·L-1,(NH4)2SO41.0 g·L-1，NaNO31.0 g·L-1，KH2PO44.0 g·L-1，K2HPO4·3H2O 25.0 g·L-1。

2.5 无机盐对菌株T1降解油泥的影响

无机盐组分正交实验结果的极差分析见图5。

图5 无机盐组分正交实验极差分析

由图5可以看出，无机盐组分对油泥降解的影响大小依次为：K2HPO4·3H2O>KH2PO4>NaNO3>NaCl>(NH4)2SO4。其中，KH2PO4、NaNO3、NaCl三者的极差非常接近，对油泥降解的影响差别不大。磷酸盐K2HPO4·3H2O和KH2PO4都能作为磷源的补充，但是K2HPO4·3H2O与KH2PO4相比，在调节培养基pH值上具有优势，能使培养基维持碱性，因此K2HPO4·3H2O比KH2PO4对油泥降解影响更大一些。

2.6 筛选菌株对油泥的降解(图6)

图6 筛选菌株对油泥的降解效果

由图6可以看出，T1、A2、Z8 3株菌对油泥的降解效果较好，油泥中原油的降解率均在60%以上，其中菌株T1的降解率为71.3%，相比对原油的降解效果有所下降，这是因为菌体所处的环境有所改变，油类的组成不同而造成的。需要对菌株进行进一步的驯化。

3 结论

筛选到了3株降解炼厂油泥中原油效果较好的菌株T1、A2、Z8，其中菌株T1的降解效果最好。菌株T1的最佳培养条件为：温度30 ℃、转速160 r·min-1、pH值9.0；最佳的培养基组成(g·L-1)为：葡萄糖25、NaCl 3.0、(NH4)2SO41.0、NaNO31.0、KH2PO44.0、K2HPO4·3H2O 25.0。虽然一代菌株对炼厂油泥的原油降解效果较为理想，但菌种传代后，降油能力有退化的现象。应寻求更加合适的手段保持菌种的降解活性，并进一步深入研究该菌对原油的降解过程以及降解机理。

参考文献：

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[2] 欧阳威，刘红，于勇勇，等.微生物强化处理与堆制强化处理含油污染对比试验[J].环境科学，2006，21(1)：160-164.

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[4] DeMello J A，Carmichael C A，Peacock E E，et al.Biodegradation and environmental behavior of biodiesel mixtures in the sea：An initial study[J].Mar Pollut Bull，2007,54(7):894-904.

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