南极微生物絮凝剂产生菌的筛选、分子鉴定及适应性研究

杜 宁

(国家海洋局 第一海洋研究所 海洋活性物质重点实验室，山东 青岛 266061)

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的可使水中的悬浮颗粒、菌体及胶体粒子凝聚、沉淀的一类高效、安全的水处理剂[1～4]，其成分一般为糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等[5]。研究表明，极地微生物较常温微生物的胞外分泌物分子量更大、成分更复杂[6～9]。因此，作者以极地微生物为筛选目标，拟开发出在经济培养基、低温环境下絮凝效率高、产量大的微生物絮凝剂。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

海水、海冰和底泥为作者在第25次南极科学考察中采集。

80目过筛高岭土。

实验所用试剂均为分析纯。

721型可见分光光度计、磁力搅拌机、恒温振荡培养箱、高压灭菌锅、PCR扩增仪、凝胶电泳仪。

1.2 培养基

通用发酵培养基：葡萄糖 20 g，KH2PO42 g，K2HPO45 g，NaCl 3.5 g，(NH4)2SO40.2 g，尿素 0.5 g，酵母膏 0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH值6.8～7.2，120 ℃灭菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 絮凝剂产生菌的分离和筛选

分别取海水、海冰和底泥，在蛋白胨固体培养基上采用平板划线法分离并纯化以获得纯菌种。将分离到的菌种置于液体培养基中，于5 ℃、120 r·min-1、pH值7左右条件下发酵培养7 d。取发酵液测其絮凝率，将具有良好絮凝率的菌株作为复筛菌种。

1.3.2 活性菌株的分子鉴定

细菌总RNA提取，16S rRNA基因序列扩增采用细菌16S rRNA 基因的通用引物，引物序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应体系总体积为2 μL，包括：1×PCR缓冲溶液、1.6 mmol·L-1MgCl2、4×dNTP混合物各100 μmol·L-1，引物各1.0 μmol·L-1，Taq RNA聚合酶1 U，模板RNA 1 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。将所测定菌株的16S rRNA基因序列与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)进行相似性比较分析。

1.3.3 活性菌株碳、氮源适应性研究

分别改变通用发酵培养基中的碳源、氮源，观察活性菌株絮凝率的变化，考察其碳、氮源适应性，筛选出在经济培养基条件下具有较高絮凝活性的菌株。

1.3.4 絮凝率测定

向100 mL烧杯中加入0.2 g高岭土、1 mL絮凝剂样品(微生物发酵液)、1 mL 1 g·mL-1的CaCl2溶液，加蒸馏水至总体积50 mL，调节溶液的pH值为7.0，置于磁力搅拌机上首先200 r·min-1下快搅1 min，然后80 r·min-1下慢搅4 min。静沉2 min，吸取上清液测定其550 nm处吸光度，同时以蒸馏水代替发酵液作对照。以絮凝率(E)表示絮凝活性，按下式计算：

E=[(A-B)/A]×100%

式中：A为对照上清液的OD550值；B为样品上清液的OD550值。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

从海水、海冰和底泥中共分离、纯化得到56株菌株，经初筛得到有絮凝活性的菌株18株，再经复筛和传代培养，得到7株具有稳定高絮凝活性菌株，见表1。

表1产微生物絮凝剂菌株筛选结果及其生存环境

Tab.1Thescreeningresultofmicrobialflocculant-producingbacteriaandtheirlivingenvironment

菌株来源温度/℃盐度/%水深/m絮凝率/%IS-11-10-1泥样-1.733.738079.75I-2冰样-10.012.1080.25I-1-2冰样-10.012.1082.25P2-14-1泥样-1.733.745252.50P2-14-2泥样-1.733.745283.75P3-06-1泥样-1.733.7297552.00P2-13-1泥样-1.733.711483.25

从表1可看出，所筛选的7株活性菌株均来自泥样和冰样，表明南极产絮凝活性的微生物以生活在海冰冰层和底质沉积物中为主。这是由于海冰冰层冰晶形成的胁迫以及底质沉积物的影响造成了这些菌株胞外分泌物的多样化与大量化，为分离纯化具有絮凝活性的物质提供了基础。

2.2 活性菌株的16S rRNA序列分析

对筛选到的7株具有絮凝活性的南极细菌基因组RNA进行扩增，获得了长度约为1.4 kb的16S rRNA序列，经比对分析后提交GenBank数据库，获得其同源相似性比较结果，见表2。

表2 7株絮凝活性菌株16S rRNA序列同源性比较

从表2可看出，所分离到的7株活性菌株与GenBank数据库已有菌株的16S rRNA序列具有很高的相似度，均在99%以上；分别隶属于不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、沙雷菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。表明筛选到的南极活性细菌没有专属性，这与目前已报道的产絮凝剂微生物种类多达几十种以上[10]相吻合。

从现有研究来看，微生物絮凝剂为多糖蛋白、粘多糖和纤维素等[11]。结合本实验筛选到微生物的生存环境来看，正是由于南极恶劣的自然环境，迫使生活在其中的细菌需要在胞外分泌大量的活性物质来抵御环境的侵害，而这类物质同时也具备了絮凝活性，这为以后改变培养条件，刺激活性菌株提高絮凝活性提供了理论基础。

2.3 活性菌株的碳、氮源适应性

2.3.1 碳源(表3)

表3 碳源对菌株絮凝活性的影响

从表3可知，当培养基中原有葡萄糖含量增加时，微生物的絮凝活性并没有明显提高，相反菌株P3-06-1失去了絮凝活性。以麦芽糖、乳糖和蔗糖作碳源时，虽然它们同属最简单的二糖，但是不同微生物将其降解成单糖葡萄糖的能力却有着很大的差别，这对降低大规模发酵成本有着很大的参考意义。另外，以复杂的多糖(可溶性淀粉)为碳源时的絮凝活性为0，说明所筛选的微生物不具备降解多糖的能力，这可能是由于南极环境中碳源种类、含量较少。在最为廉价的蔗糖实验中，菌株I-2、I-1-2、P2-14-1、P2-14-2和P2-13-1的絮凝率保持在80%以上，表明其具有碳源普适性。

2.3.2 氮源(表4)

表4 氮源对菌株絮凝活性的影响

从表4可知，南极产微生物絮凝剂活性菌对分子量小、结构简单的无机营养盐有着更好的利用能力。在最为廉价的氯化铵实验中，菌株P2-13-1、I-2的絮凝率分别为85.00%、41.06%；而在较廉价的硫酸铵实验中，菌株I-2、P2-14-1和P2-13-1均表现出较高的絮凝率。表明菌株I-2和P2-13-1具有氮源普适性。

3 结论

从南极海水、海冰、底泥中分离得到7株产絮凝剂的菌株。分子鉴定表明，筛选到的南极活性细菌没有专属性，分别隶属于不动杆菌属(Acinetobacter)、节杆菌属(Arthrobacter)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、沙雷菌属(Serratia)、假单胞菌属(Pseudomonas)和假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。改变培养基中碳源和氮源的组成并观察絮凝率的变化，筛选出在经济培养基条件下具有较高絮凝活性，同时对碳源和氮源具有普适性的菌株I-2和P2-13-1，可以作为下一步大规模发酵研究微生物絮凝剂的实验菌种。

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