红曲霉菌株的分离鉴定及产红曲色素发酵条件优化

庄禧懿，储卫华,，马兴旺，朱 卫

(1.中国药科大学生命科学与技术学院,江苏 南京 210009；2.南京日升康生物工程有限公司，江苏 南京 211103)

红曲霉菌属真菌界(Eumycophyta)、子囊菌门(Ascomycota)、真子囊菌纲(Euascomycetes)、散子囊菌目(Eurotiales)、红曲菌科(Monascaceae)、红曲菌属(Monascus)[1]。由红曲菌接种于大米发酵得到的红曲具有防腐、解毒、消食活血、健脾燥胃之功效[2]，同时，红曲菌具有很强的产色素能力，红曲色素作为天然色素应用于食品着色历史悠久。红曲色素分为黄色素、橙色素和紫红色素[3，4]。急性毒性试验、亚急性毒性试验、慢性毒性试验和致突变试验表明，红曲色素无毒副作用和致突变作用。随着人们对合成食品添加剂和化学药物对人体毒副作用的认识，世界各国掀起了食用绿色食品和使用天然药物的热潮，红曲作为药食兼用的天然制品，引起了极大的关注。与化工合成的色素相比，红曲色素具有安全性高、稳定性好、色调柔和、pH值稳定、对蛋白质的着色力强且兼具抗菌性等特点，是一种具有悠久应用历史的天然色素[5,6]。

作者从市售不同红曲发酵产品中分离得到红曲霉纯培养菌株，根据形态学特征进行属和种的鉴定，并对其发酵产红曲色素工艺进行初步研究，为进一步发掘红曲菌生物资源做了有益探索。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

市售功能性红曲米粉，红曲发酵饲料，红腐乳等。

乳酸，无水乙醇。

高压灭菌锅，电热恒温培养箱，恒温摇床，超净工作台，显微镜，UV-2100 型分光光度计等。

1.2 培养基

分离培养基：(1)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)；(2)孟加拉红培养基；(3)麦芽汁液体培养基加乳酸调pH值2.5，加10%(体积分数，下同)乙醇。

形态鉴定平板培养基：(1)麦芽汁琼脂培养基(Wa培养基)；(2)察氏琼脂培养基；(3)PDA培养基。

液体发酵培养基(g·L-1)：葡萄糖90，蛋白胨30，KH2PO41.0，MgSO41.0，MnSO40.1，ZnSO40.1，pH值6.0。

1.3 方法

1.3.1 红曲霉菌株的分离

称取10.0 g 红曲粉，加入到90 mL带玻璃球的无菌生理盐水中，振摇10 min，10倍梯度稀释。吸取0.1 mL稀释液涂布于分离培养基上，30 ℃培养3～7 d，挑取单菌落转移接种到新的分离培养基培养，经反复分离纯化得到较纯的菌株，保藏。

1.3.2 菌株形态学观察

将筛选的菌株的孢子划线接种到形态鉴定培养基平板上，放入培养箱中，30 ℃倒置培养，每天观察记录各菌株的菌落形态。菌丝和孢子显微结构的观察采用插片培养法[7]，将接种好的培养皿置于30 ℃恒温培养箱中培养，定期取出盖玻片观察其菌丝结构、繁殖结构等形态特征。

1.3.3 液体发酵及色价测定

制作液体发酵培养基，分装到三角瓶中，装液量为50 mL/250 mL，灭菌待用。无菌条件下将分离纯化的菌株制成孢子悬液，接种于发酵培养基，30 ℃、180 r·min-1下摇床培养，考察接种量、培养基初始pH值等条件对产红曲色素的影响。

红曲色素的提取及其色价测定[8]：取发酵液5 mL，加入75%乙醇45 mL，静置浸提4 h，过滤。滤液再以75%乙醇稀释适当倍数后，以75%乙醇作空白对照，在波长510 nm处测定OD值。将OD值乘以稀释倍数，即为红曲色素色价(单位为 U·mL-1)。

2 结果与讨论

2.1 产红色素菌株的分离纯化及形态

将不同的红曲产品接种到分离培养基上，经过一段时间的培养，获得了15株菌株， 其中一株肉眼可见产红色素高于其它菌株，命名为RP-1。将RP-1孢子稀释液涂布PDA培养基平板，30 ℃培养，3～4 d 后可见白色团状菌丝，7 d 后菌丝转为红色，红色素扩散至整个培养基中(图1)。

图1 产红色素霉菌在PDA培养基上的生长特征

2.2 RP-1形态学鉴定

在普通光学显微镜下观察(图2)，RP-1的菌丝呈不规则型分枝，多核，有横隔，含油滴，无色透明或含深浅不一的红色素，分生孢子呈球形，着生于菌丝及其分枝的顶端，孢子单生或链状，闭囊壳球形，有柄。根据菌落及显微形态，初步鉴定RP-1为红色红曲菌(Monascusruber)。

图2 RP-1显微形态特征(10×40)

2.3 培养条件对RP-1产红曲色素的影响

2.3.1 接种量

接种量会对微生物生物量及代谢产物产生较大的影响。分别选用4种不同的接种量(1%、5%、10%和15%)进行实验，经过7 d的培养，结果发现，随着接种量的增加，红曲色素色价提高，当接种量为15%时，其色价达到126.0 U·mL-1。

2.3.2 培养基初始pH值

pH值是微生物生长和产物合成过程中重要的生理参数之一，对微生物酶活有显著的影响，同时还会引起细胞膜透性以及菌体形态的变化，从而影响菌体对养分的吸收和代谢产物的分泌。培养基初始pH值分别设定为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0进行实验，结果发现，当培养基初始pH值为4.0时，红曲色素色价为47.8 U·mL-1；当培养基初始pH值为5.0时，红曲色素色价有所上升，但不明显；当培养基初始pH值为6.0时，其色价最高，达132.0 U·mL-1；而当培养基初始pH值为7.0时，其色价有所下降；当培养基初始pH值为8.0时，其色价为115.6 U·mL-1。这可能跟真菌的适宜生长pH值有关。因此，红曲霉RP-1液体发酵产红曲色素的培养基最佳初始pH值为6.0。

2.3.3 讨论

后家衡等[9]研究表明，接种量为5.0%、培养温度为30 ℃、培养时间为72 h、培养基初始pH值为6.0时，3 株红曲霉中以Mg 菌株产色素最高，并在以番薯粉为碳源的培养基中色素产量最高；而刘德华等[10]研究表明，5%～20%的接种量、培养基初始pH值7.0最有利于红曲色素的合成。他们的研究结果与本研究有所差别，表明红曲霉不同菌株产色素能力有着很大差异，优化发酵条件可以显著提高色素色价，因此进行色素高产菌株筛选和发酵条件优化是十分有必要的。

3 结论

从市售红曲发酵产品中成功分离得到15株红曲霉纯培养菌株，其中一株肉眼观察高产红色素，通过形态特征观察，初步鉴定该菌株为红曲属(Monascus)中的红色红曲菌(Monascusruber),命名为RP-1。下一步有必要对分离到的RP-1进行18S rDNA、GC含量测定以进行准确鉴定。

对红曲霉RP-1的液体摇瓶发酵工艺进行了初步研究，结果发现，接种量以及培养基初始pH值等发酵参数对红曲霉RP-1液体发酵产红曲色素色价有影响，接种量为15%、培养基初始pH值为6.0时，最有利于红曲色素的合成。

参考文献：

[1] 李钟庆，郭芳.红曲菌的形态与分类学[M].北京：中国轻工业出版社，2003：2～6，11，45-48.

[2] 邢旺兴，程荣珍，宓鹤鸣，等.几种常见红曲霉的生理学特性研究[J].药学实践杂志，2001，19(4)：231-234.

[3] Wong H C，Koehler P E.Mutant forMonascus-pigment production[J].Food Science,1981，46(3)：956-957.

[4] Bai M D，Cheng C H，Wan H M，et al.Microalgal pigments potential as byproducts in lipid production[J].Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers，2011，42(5)：783-786.

[5] Carvalho J C，Oishi B O，Pandey A，et al.Biopigments fromMo-nascus：Strain selection，citrinin production and color stability[J].Brazilian Archives of Biology and Technology,2005，48(6)：885-894.

[6] Mapari S A S，Nielsen K F，Larsen T O，et al.Exploring fungal biodiversity for the production of water-soluble pigments as potential natural food colorants[J].Current Opinion in Biotechnology，2005，16(2):231-238.

[7] 周长林.微生物学实验与指导(第二版)[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

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[9] 后家衡，叶砚，徐晓波,等.红曲霉产色素发酵条件优化及抑菌性能的测定[J].上海交通大学学报(农业科学版),2009,27(4):363-367.

[10] 刘德华，刘代喜，丁海洋,等.红曲霉JR液体发酵产红曲色素的工艺研究[J].中国酿造，2010，(5)：59-61.