两株红色糖多孢菌在不同氮源培养条件下的代谢比较

黄 刚，周 英，叶邦策

(华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237)

红色糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)最初是由McGuire等人于1952年从土壤中分离得到的，是一种革兰氏阳性放线菌，属糖多孢菌属[1]，与经典的链霉菌(如阿维链霉菌和天蓝色链霉菌)有较高的生物同源性。Markiyan Oliynyk在《Nature》上刊登了红色糖多孢菌模式菌株NRRL23338的全基因组测序信息，为更加全面和系统地研究这一菌株奠定了基础。红色糖多孢菌因用于工业规模的红霉素生产而受到广泛关注和深入的研究。红霉素(Erythromycin，Er)是一种含有十四元环的大环内酯类抗生素[2]，具有广泛的抗菌效能，包括多种成分，主要有红霉素A(Er A)、红霉素B、红霉素C、红霉素D等，其中红霉素A是最早分离出来的，也是起主要病理作用的成分。

对于红色糖多孢菌的研究，目前主要集中在对红霉素生物合成相关分子机制的探索和红霉素发酵工艺的改进。其中红霉素的合成模式已被作为聚酮类抗生素的合成典范得到了详尽阐述，工业生产也达到了几十吨甚至上百吨的规模。近年来，红色糖多孢菌的研究有了新的发展和突破，如组学、代谢网络分析对于抗生素合成代谢调控的阐述以及基于代谢流分析的多尺度优化提高生产能力[3]等。尽管针对红色糖多孢菌代谢网络及红霉素合成机制已经做了大量研究工作[4]，但是由于微生物代谢的复杂性，红霉素合成的全基因组水平上的调控机制仍然远远没有阐释明确。而氮源代谢作为与抗生素合成紧密相关的代谢途径，在链霉菌中也进行了较多的阐述[5,6]。

转录组芯片和凝胶阻滞(EMSA)等实验发现，在红霉素高产菌株中，与氮源代谢相关的基因(如glnR、glnB)、铵盐与寡肽转运蛋白基因等在高产菌株中被强烈抑制。可推测在高产菌株和野生菌株中，氮源代谢存在很大差异，并与红霉素合成存在紧密的联系。作者在此进一步对高产菌株和野生菌株在不同氮源条件下的代谢进行比较，通过测定相应胞内氨基酸和有机酸的含量，探索氮源代谢与红霉素合成的关系。

1 实验

1.1 试剂与仪器

RNeasy Mini RNA提取试剂盒，Qiagene公司；谷氨酸/谷氨酰胺ELISA测试试剂盒，上海锐聪生物科技有限公司；红霉素、谷氨酸、谷氨酰胺标准品，Sigma公司；甲醇、乙腈，CNW公司；其它试剂均为国产化学纯或者分析纯。

LC-20AT型高效液相色谱仪，日本岛津贸易公司；多功能酶标仪，美国Biotech公司。

1.2 菌株

红色糖多孢菌模式菌SaccharopolysporaerythraeaNRRL23338，记为M菌，德国菌株保藏中心；红霉素高产菌，记为A菌，华东理工大学发酵工程实验室。

1.3 培养基

种子培养基为GYM培养基(g·L-1)：葡萄糖4.0，酵母提取物4.0，麦芽提取物10.0，pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基为SCM培养基(g·L-1)：葡萄糖30，酵母提取物6，蛋白胨4，甘氨酸2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.68，pH值7.0，121 ℃灭菌25 min。

单一氮源培养基为在Evans培养基[7]中分别加入1%的蛋白胨、L-谷氨酰胺、硫酸铵、硝酸钠。

1.4 方法

1.4.1 胞内代谢物的提取[7]及测定

取发酵液20 mL，5000 r·min-1离心30 min，去上清，用等体积的60%乙醇重悬；放入液氮中冻融10 min，置于室温溶解，反复冻融3次；用超声波破碎仪超声10 min(60次)，功率为300 W，工作时间3 s/间隙时间7 s；超声完成后于5000 r·min-1离心30 min，取上清,经冷冻、真空干燥、浓缩，即得胞内代谢物。

色谱条件：Intersil ODS-4 C18反向色谱柱(4.0 mm×250 mm，5 μm)；流动相为0.027%浓硫酸(含0.0005 mol·L-1的十二烷基磺酸钠)；pH值2.5；流速0.8 mL·min-1；柱温30 ℃；紫外检测波长210 nm。

1.4.2 谷氨酸和谷氨酰胺的测定

谷氨酸和谷氨酰胺的测定参照酶联免疫(ELISA)测试试剂盒说明书进行，显色后用酶标仪读取吸光值。

1.4.3 红霉素效价的测定

取1 mL发酵液，于12 000 r·min-1高速离心5 min，取上清，采用磷酸水解法测定红霉素效价[8]：将上清用0.22 μm的微孔滤膜过滤处理，并将滤液用超纯水稀释到200 μg·mL-1；吸取稀释的样品0.8 mL于10 mL的容量瓶中，加入4 mL 10 mol·L-1的磷酸，摇匀；将容量瓶置于沸水中煮3 min，再冷至室温，用10 mol·L-1的磷酸定容到10 mL，摇匀；以超纯水作为空白对照，测定各处理后的样品在485 nm处的吸光值。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸及有机酸的标准曲线(表1)

表1 氨基酸及有机酸的标准曲线

2.2 不同氮源条件下的氨基酸和有机酸的含量

不同氮源条件下，野生模式菌(M菌)和高产菌(A菌)在不同时间取样，测定的氨基酸含量见图1、有机酸含量见表2。

图1 红色糖多孢菌的谷氨酸与谷氨酰胺含量

表2 红色糖多孢菌在不同时间的胞内有机酸含量/μg·g-1

由图1和表2可以看出，在4种不同氮源培养条件下，M菌与A菌体内的氨基酸和有机酸含量存在显著差异，同一菌株体内的氨基酸和有机酸含量也存在显著差异。

在同一菌株内，与氮源代谢直接相关的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量和与碳源代谢相关的有机酸如苹果酸、柠檬酸的含量在不同的氮源培养条件下呈现相反的趋势。以18 h取样为例，以硫酸铵作为唯一氮源时A菌体内的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺的胞内含量达到最高，分别为8.81 μg·g-1、170 μg·g-1、140 pg·g-1，而苹果酸和柠檬酸的含量则最低。

不同菌株间，以硫酸铵作为氮源时，A菌体内的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量较M菌显著升高，苹果酸和柠檬酸含量却更低。这与芯片数据显示的在工业菌株中铵盐转运蛋白被强烈抑制的结果仿佛存在矛盾，但之前有报道在其它菌属中，当铵盐浓度升高时，微生物会通过对体内的谷氨酰胺合成酶(GS)进行腺苷酰化来提高其催化能力[9]，从而有效保持体内谷氨酸与谷氨酰胺的含量。在次级代谢和初级代谢上，M菌初级代谢水平高于A菌，不利于抗生素等的合成。

硝酸钠和蛋白胨对两菌株的影响较为接近，A菌与M菌对这两种氮源的利用都不会出现太多障碍，因为蛋白胨本身作为复合型的氮源，为微生物的生长和代谢提供了多样的营养选择，在A菌体内，由芯片数据可知硝酸钠的转运得到了促进，因此虽然是单一的氮源，但工业菌能有效对其进行吸收和利用。而对于L-谷氨酰胺，由于其转运蛋白在A菌体内受到强烈抑制，因此与氮源代谢相关的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺都明显处于最低水平，也影响到了菌体的生长，柠檬酸循环中相应的有机酸含量也较低。这些都与芯片数据所反映的情况一致。

对于红霉素的合成，在硫酸铵、硝酸钠和谷氨酰胺作为唯一氮源时，A菌的产量并不与野生菌存在差异，只有在复合氮源蛋白胨存在的情况下，红霉素产量有较明显的提高。这可能是因为，单一氮源并不足以长时间保证红色糖多孢菌体内碳氮源代谢的平衡，影响了菌体的生理状态，pH值容易偏低，从而不利于红霉素的合成。因此，进一步实验可采取在基本培养基上添加过量的氮源并测定更多的代谢产物如红霉素合成前体物质等，更全面地考察红霉素的产量与氮源添加的关系以及相关氮源代谢阻遏等机理。

2.3 讨论

传统的分子生物学手段在抗生素合成及相应菌株的研究中遇到了瓶颈[10]，基因组、转录组、代谢组等组学技术以全局性阐明链霉菌等体内代谢调控网络的方式应用越来越受到重视，但受限于微生物的复杂性和对庞大数据进行有效挖掘，还需要对组学分析结果进行分子生物、发酵等实验的探索验证[11]。

本研究以实验室之前转录组基因芯片实验为指导，通过不同氮源添加实验，测定了在不同氮源条件下，红色糖多孢菌野生菌和高产菌体内与氮源代谢相关的氨基酸、有机酸的含量，展示了不同菌株内的代谢情况。在铵盐、谷氨酰胺过量时，高产菌株有效抑制了对其吸收，但体内的谷氨酸、谷氨酰胺等处于高水平，可能是增强了谷氨酰胺合成酶(GS)等的催化活性的结果。并且在高产菌株中，与初级代谢相关的有机酸含量明显低于野生菌株，这也说明高产菌株与野生菌株在代谢上的差异决定了抗生素的合成水平。测定结果与芯片数据分析结果较为吻合，从而说明了芯片实验的可行性及可信度。这些工作还在进一步展开和优化过程中，但转录组等组学水平实验结果指导后续的发酵和基因工程改造研究，将是系统研究菌株特性和抗生素合成的有效手段。

3 结论

通过测定4种单一氮源培养条件下的野生模式菌(M菌)和高产菌(A菌)体内的有机酸和氨基酸含量来比较其代谢情况。结果表明，在同一菌株内及不同菌株间，与氮源代谢直接相关的α-酮戊二酸、谷氨酸、谷氨酰胺的含量和与碳源代谢相关的有机酸如苹果酸、柠檬酸的含量在不同的培养基内呈现相反的趋势。

参考文献：

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