雷莫拉宁的分离纯化工艺研究

朱秀良，王海燕，李 宁，林 毅，李晓露，张雪霞，蒋 沁

(微生物药物国家工程研究中心 河北省工业微生物代谢工程技术研究中心,华北制药集团新药研究开发有限责任公司,河北 石家庄 050015)

雷莫拉宁(Ramoplanin，A-16686，MDL62)是一种新型的糖肽类抗生素，由意大利Cavalleri等[1]在游动放线菌(Actinoplanessp.)中首次分离得到，主要抑制革兰氏阳性菌的生长，其纯品是由A1、A2、A3、A1′、A2′、A3′、Ramoplanose等7个组分组成的混合物，其中A2为主要成分，占75%左右[2]。

雷莫拉宁抑制细胞壁上肽聚糖的生物合成，其抑菌机制与万古霉素及替考拉宁的抑菌机制不同；在体内、体外的试验中，雷莫拉宁均表现出良好的广谱抗菌活性，大部分病原菌(革兰氏阳性菌)对雷莫拉宁敏感性均高于万古霉素和替考拉宁；雷莫拉宁的细胞毒性要比其它糖肽类抗生素小且无明显不良反应及肾毒性[2]。因此，雷莫拉宁用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病前景较好。

目前，关于雷莫拉宁的分离纯化研究较少，且已有的制备工艺繁琐、成本高、所得产品纯度低[3～5]。作者在此根据雷莫拉宁化学结构中羟基多的特点，以聚酰胺树脂为分离介质，从发酵液中分离纯化雷莫拉宁，并对吸附及解吸条件进行了优化，以期得到高纯度雷莫拉宁。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

雷莫拉宁发酵液，华药集团新药公司；雷莫拉宁标准品，自制；大孔树脂LX-2000、LX-18，西安蓝晓科技有限公司；大孔树脂HZ801，上海华震科技有限公司；聚酰胺树脂，上海沪峰生物科技有限公司；珍珠岩助滤剂，廊坊三新珍珠岩制品有限公司；去离子水，自制；乙腈(色谱纯)，美国Merck公司；工业乙醇，沧州兴隆化工有限公司；其它试剂均为国产分析纯。

高效液相色谱仪(996检测器，515泵)，Waters公司；Loborata 4000型旋转蒸发器，Heidolph公司；TGL-16G型高速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 HPLC检测条件

色谱柱：Agilent Eclipe XDB C8(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流动相：乙腈-酸水(0.1% H3PO4)(80∶20，体积比)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

1.3 雷莫拉宁浸提液的制备

在发酵液中加入5%～7%珍珠岩助滤剂，搅拌30 min，真空抽滤，用水洗涤得菌丝体；将菌丝体用适量80%乙醇-酸水(pH值3.0～3.5)搅拌下浸泡2 h，真空抽滤，得雷莫拉宁浸提液。

1.4 树脂的筛选

根据雷莫拉宁弱极性及多羟基的特性，分别量取LX-2000、LX-18、HZ801和聚酰胺等4种弱极性吸附树脂20 mL于4根适当的玻璃柱中，从柱顶注入雷莫拉宁浸提液至有目标产物从树脂柱上流出时，停止上样。以树脂对雷莫拉宁的绝对吸附量为指标，并参照解吸收率进行筛选。

1.5 吸附条件的考察

1.5.1 雷莫拉宁浸提液浓度的选择

将雷莫拉宁浸提液用NaOH溶液调pH值为6.5～7.5，减压浓缩除去乙醇，浓缩液过滤除去不溶物，再加去离子水稀释成不同浓度(μg·mL-1)：400、800、1200、1600、2000、2400、2800、3200，分别上聚酰胺树脂柱(树脂装量20 mL，流速1.0 BV·h-1)，HPLC在线检测，当有目标产物流出时，停止上样，计算吸附量，确定最佳雷莫拉宁浸提液浓度。

1.5.2 吸附流速的选择

选择流速(BV·h-1)分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0，每10 mL流出液为一个样品，测其浓度，计算泄漏率，确定最佳吸附流速。

1.6 解吸条件的考察

取200 mL处理好的聚酰胺树脂装柱，将1000 mL 1600 μg·mL-1雷莫拉宁浸提液从柱顶注入，控制流速为1.0 BV·h-1。上样完毕，依次采用体积分数为30%、50%、60%、70%、80%的乙醇解吸，解吸流速为0.5 BV·h-1。分段收集解吸液，HPLC在线检测，计算不同体积分数乙醇的解吸收率，并结合解吸液质量确定最佳解吸条件。

1.7 结晶

45 ℃下，将解吸液减压浓缩至20 mg·mL-1左右，搅拌下缓缓加入8～10 BV丙酮，室温静置4 h，抽滤，丙酮洗涤，真空干燥，得到雷莫拉宁白色结晶粉末。

2 结果与讨论

2.1 树脂的筛选(表1)

表1 不同类型树脂对雷莫拉宁的吸附量及解吸收率

由表1可知，聚酰胺树脂对雷莫拉宁的吸附量和解吸收率明显大于其它树脂，可以达到对雷莫拉宁的富集作用，而且聚酰胺树脂的解吸液颜色较浅。故选用聚酰胺吸附树脂进行后续实验。

2.2 吸附条件的优化

2.2.1 雷莫拉宁浸提液浓度对树脂吸附量的影响(图1)

图1 雷莫拉宁浸提液浓度对聚酰胺树脂吸附量的影响

由图1可见，在相同的流速下，雷莫拉宁浸提液浓度越低，吸附量越高，但生产周期越长；雷莫拉宁浸提液浓度过高，又不利于树脂吸附，吸附量较低。因此，选择雷莫拉宁浸提液浓度为1600～2000 μg·mL-1。

2.2.2 吸附流速对树脂吸附量的影响(图2)

图2 吸附流速对聚酰胺树脂吸附量的影响

由图2可见，吸附流速大于1.0 BV·h-1后，泄漏率明显升高；而吸附流速为0.5 BV·h-1与1.0 BV·h-1时的泄漏率相差不大。因此，选择吸附流速为1.0 BV·h-1。

2.3 解吸条件的优化

用不同体积分数的乙醇洗脱树脂，结果见表2。

表2不同体积分数乙醇的解吸收率

Tab.2Desorptionyieldatdifferentvolumefractionsofethanol

乙醇体积分数%解吸液体积/mL浓度/μg·mL-1纯度/%解吸收率%306000-0506002715.00.360600111085.535.670600173392.660.28060040.279.71.2

由表2可知，当乙醇体积分数小于50%时，洗脱的是一些色素和杂质；乙醇体积分数为60%时，洗脱不完全，解吸收率仅35.6%，这是由于乙醇体积分数低，树脂孔径未能充分溶胀，不利于雷莫拉宁在乙醇中的溶解；乙醇体积分数为70%时的解吸液浓度最高，且杂质较少，纯度也相对较高，说明70%乙醇有利于目标产物的洗脱；乙醇体积分数为80%时，解吸液浓度很低，纯度也不高，解吸收率仅1.2%，说明目标产物已被洗脱完全。故，确定洗脱条件为：先用30%或50%乙醇洗去极性大的杂质，再用70%乙醇洗脱。

将解吸液减压浓缩至20 mg·mL-1左右，加入8～10 BV的丙酮，静置4 h后，抽滤，用丙酮洗涤，真空干燥，得到纯度大于95%的雷莫拉宁晶粉。

2.4 工艺验证

在上述最佳分离纯化工艺条件(以聚酰胺树脂作为分离介质，雷莫拉宁浸提液浓度1600～2000 μg·mL-1，吸附流速1.0 BV·h-1,乙醇作洗脱剂)下，连续进行3批验证实验，结果见表3。

表3 验证实验结果

由表3可知，在最佳分离纯化工艺条件下，总收率均超过80%、产品纯度大于95%。

3 结论

采用聚酰胺吸附树脂分离纯化发酵液中的雷莫拉宁，在雷莫拉宁浸提液浓度为1600～2000 μg·mL-1、吸附流速为1.0 BV·h-1、乙醇作洗脱剂(先用30%或50%乙醇洗脱，再用70%乙醇洗脱)时，可得到高纯度雷莫拉宁，总收率超过80%，纯度大于95%。该方法简单易行，收率稳定，安全性高，适合工业化生产。

参考文献：

[1] Cavalleri B，Pagani H，Volpe G,et al.A-16686，a new antibiotic fromActinoplanes.I.Fermention，isolation and preliminary physico-chemical characteristics[J].J Antibiot，1984，37(4):309-317.

[2] 郭月玲,赵子弟,倪慧敏，等.新型糖肽类抗生素雷莫拉宁研究进展[J].河北化工,2011,34(8):28-31.

[3] 李继安,徐斌.一种雷莫拉宁的纯化方法[P].CN 101 024 662,2007-08-29.

[4] 李继安,卢亮,张宏宇.雷莫拉宁的分离方法[P].CN 101 838 315A,2010-09-22.

[5] 张春颖,周青.应用纳滤浓缩纯化技术从发酵液中制取雷莫拉宁[P].CN 102 010 462，2011-04-13.