经前平颗粒对愤怒情绪模型大鼠不同脑区单胺类神经递质的影响及分析

宗绍波，魏 盛，孙 鹏，侯金良，乔明琦

(山东中医药大学1.中医药经典理论教育部重点实验室、2.脑行为分析实验室，山东济南 250355)

怒是最不可忍受、对人际关系与社会稳定影响最大、与疾病发生关系最为密切的负性情绪反应之一。乔明琦等［1］认为怒有愤怒和郁怒两种亚型。研究［2－3］发现，经前期综合征、焦虑、抑郁、心脑血管疾病及癌症都与之有密切关系。可见愤怒是重要的致病因素之一。现代医学认为怒主要是通过引起神经－内分泌－免疫网络系统的失调而致病的。大量的研究表明［4］，单胺类神经递质去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺等均参与人和动物的行为及精神情绪活动。经前平颗粒是以香附、白芍、柴胡等为主要药材的中药复方，具有平肝理气，除胀止痛，佐以和胃之功效。本研究借助HPLC技术分别检测大鼠不同脑区单胺类神经递质的含量变化，为初步探明愤怒发病机制及调肝方药经前平颗粒的干预机制提供依据。经前平颗粒是2000年国家批准的三类新药，主要成分包括白芍345 g，香附345 g，川楝子(炒)345 g，柴胡 228 g，川芎 228 g，枳壳 228 g，豆蔻 228 g，半夏(姜制)345 g，木香 228 g，甘草 228 g。经前平颗粒制法符合中国药典2000年版一部附录IC中颗粒项下有关的各项规定。白芍是经前平颗粒的君药，白芍中所含主要成分为芍药苷，因此以芍药苷为指标，对经前平颗粒中的芍药苷用薄层紫外分光光度法(中国药典2000年版一部附录Ⅵ B)进行含量测定，本品每1 g含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于1.5 mg为其质量标准。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级健康♂ Wistar(居住鼠)大鼠，体质量250 g左右;SD大鼠(入侵鼠)若干，180 g左右。山东中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(鲁)20050015。

1.1.2 实验仪器 旷场箱(自制);数码摄像机NV-MX7D(日本);电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司);Agilent 1100高效液相色谱仪;LGR16-W高速冷冻离心机(北京医用离心机厂);优普超纯水机(成都超纯科技有限公司)。

1.1.3 实验药品 经前平颗粒(扬子江药业集团江苏制药有限公司生产，批号:05111501);生理盐水;无水乙醇;去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)、多 巴 胺 (dopamine，DA)、5-羟 色 胺 (5-Hydroxytryptamine，5-HT)均为 Sigma公司产品(A.R级);乙酸钠、柠檬酸、辛烷基磺酸钠、二正丁胺、乙二胺四乙酸均为分析纯;甲醇为色谱纯;水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制备、分组、行为学评价及给药采用旷场实验和糖水偏好实验［5－6］筛选得分相近的大鼠进入实验，造模1周后，随机分为模型组和愤药组。实验设置空白对照组、模型组、经前平给药组(简称愤药组)，每组10只;愤药组灌胃给予经前平颗粒，每天上午9:00灌胃给药1次，给药量0.16 g·kg－1体质量(相当于人临床8倍剂量)，愤模组(造模同时)和空白组灌胃给予饮用水，连续给药7 d采用旷场实验和糖水偏好实验对模型进行评价。

1.2.2 取材 评价实验后，每只大鼠迅速断头取脑，并剥离出下丘脑(hypothalamus)、海马(hippocampus)、顶区皮质(parietal cortex)、额叶皮质(prefrontal cortex)，精确称量后移至玻璃匀浆器中，加入预冷的0.5%HClO41 ml，于冰浴上充分研磨，0～2℃制成匀浆，3 500 r·min－1低温离心 15 min，取上清备用。

1.2.3 神经递质测定

1.2.3.1 溶液制备［7］标准品溶液制备:分别精密称取NE、DA、5-HT适量，用流动相溶解并稀释成300 mg·L－1的标准贮备液。分别取贮备液稀释成NE:0.003、0.3、0.35、3、4 mg·L－1;DA:0.001、0.1、0.5、1、1.5 mg·L－1;5-HT:0.002、0.1、0.2、0.4、2 mg·L－1得各组分的标准品对照液。供试液制备:取“1.2.2”项下制备的上清液，再加入等体积5%HClO4溶液，12 000 r·min－1低温离心 15 min，取上清0.22 μm微孔滤膜过滤即得供试液。

1.2.3.2 色谱条件［8］在前期检测基础上对色谱条件加以改进，色谱柱:ZORBA×SB-C18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm Agilent);流动相:甲醇18%(V/V)－乙酸钠100 mmol·L－1，柠檬酸85 mmol·L－1，二正丁胺0.4 mmol·L－1，辛烷基磺酸钠1.5 mmol·L－1，乙二胺四乙酸(EDTA)0.2 mmol·L－1，调 pH值为 3.7。流速:0.9 ml·min－1;进样量:20 μl;柱温:35℃;工作电压:0.4 mV、量程:1 μA。

1.2.5 统计处理 实验数据用Graphpad Prism5.0统计作图软件分析(GPW5-384305-RAG-5235，Graphpad software，Inc.2236 Avenida de la PlayaLa Jolla，CA 92037 USA)，各项数据以±s记录。旷场及糖水偏好实验采用双因素;单胺类神经递质数据采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 旷场实验及糖水偏好实验 由Fig 1可见，造模刺激后愤怒大鼠模型旷场实验得分明显上升(P＜0.05)，而造模2周后糖水偏好系数明显下降(P＜0.05);药物干预后上述指标均得到一定程度恢复，但与模型组差异无显著性(P＜0.05)。

2.2 标准曲线 取“1.2.3.1”项下的对照品溶液，按本文色谱条件测定，各对照品色谱图见Fig 1A。以峰面积A对浓度C进行线性回归，NE、DA、5-HT的回归方程分别为:NE:Y=5.2016X－0.2331;r=0.9996;DA:Y=6.6047X+3.145;r=0.9997;5-HT:Y=3.8619X －0.2799;r=0.9999。

Fig 1 Open-field test(A)and sucrose preference test(B)results of control，anger-out model，Jingqianping treatment rats(±s，n=10)

结果表明，3种组分分别在 3～4 000、1～1 000、2 ～2 000 μg·L－1范围内，线性关系良好。

2.3 回收率及精密度 取大鼠脑组织，经预处理后测定峰面积，再取上述组织分别添加已知量的3种不同浓度的标准对照液，分别测出NE、DA、5-HT在样品中的含量，与先前脑组织样品测得的含量相对比，计算3种递质的回收率;另配制相应浓度的标准品溶液，日内连续测5次，连续测定5 d，计算得日内日间精密度。结果见Tab 1。

2.4 各组大鼠不同脑区神经递质含量检测结果(Fig 2)

Fig 2Results of NE(A)，DA(B)and 5-HT(C)HPLC test from rat parietal cortex(a)，prefrontal cortex(b)，hypothalamus(c)and hippocampus(d)(±s，n=10)

2.4.1 各组大鼠不同脑区NE含量检测结果 由Fig 2A可见，愤模组中，大鼠下丘脑NE含量与正常组相比差异具有显著性(P＜0.01)，其它脑区与正常组相比差异无显著性;给药干预后，顶区皮质、额叶皮质、下丘脑、海马NE含量均较愤模组上升(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01);愤药组中，除额叶皮质外，其余各脑区NE含量与正常组相比差异均有显著性(P＜0.01)。

2.4.2 各组大鼠不同脑区DA含量检测结果 由Fig 2B可见，愤模组中，各脑区DA含量与正常组比较差异均有显著性(P＜0.01)，其中下丘脑DA含量上升，海马DA含量降低;给药干预后，各脑区DA含量与愤模组相比差异均有显著性(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01)，其中大鼠顶区皮质 DA含量较愤模组上升(P＜0.01)，额叶皮质、海马DA含量则下降(P＜0.01)。愤药组中，除下丘脑外，其余各脑区与正常组比较差异均有显著性(P＜0.01，P ＜0.01，P ＜0.01)。

Tab 1 Experimental result of recovery and precision(n=5)

2.4.3 各组大鼠不同脑区5-HT含量检测结果由Fig 2C可见，愤模组中，除下丘脑大鼠顶区5-HT含量较正常对照组下降外(P＜0.01)，其余各脑区差异均无显著性;给药干预后，下丘脑、海马5-HT含量与愤模组相比含量均上升(P＜0.05)，其余脑区较愤模组差异无显著性;愤药组中，除顶区皮质外，额叶皮质、下丘脑、海马均较正常组差异有显著性(P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)。

3 讨论

居住入侵及社会隔离均为动物行为学领域经典造模方法，国内外医学界应用以上方法成功制备出多种情绪类疾病动物模型［9－10］。在课题组前期研究基础上，本研究采用居住入侵结合社会隔离的方法制备愤怒模型大鼠［5］。旷场实验和糖水偏好实验的结果表明大鼠愤怒模型制备成功。攻击行为被认为是愤怒情绪引发的典型行为［5］。攻击行为与动物情绪的调控神经环路相似。有动物实验［11］发现，脑中5-HT及5-HT代谢物水平下降可能增加冲动和攻击行为，Siever研究［12］认为 DA、NE均有提高冲动攻击行为的可能性。本实验研究结果显示，模型大鼠下丘脑中5-HT明显下降，而DA明显上升，这与上述报道相吻合。说明愤怒应激刺激能够间接或直接降低中枢5-HT系统功能和提高中枢DA能神经系统的功能水平。下丘脑中单胺类神经递质的含量很高，且是自主神经系统的整合中枢，在维持机体内环境稳定及决定情绪、行为反应等方面起着重要作用［13］。课题组前期研究认为肝主疏泄可能通过调节机体该类活性物质含量而呈现作用，其功能与下丘脑密切相关［14］。经前平颗粒给药干预后，额叶皮质NE、下丘脑DA含量异常波动变化得到纠正。因此，经前平颗粒能够通过调节不同脑区单胺类神经递质而发挥作用。从侧面反映了中药复方作用多靶点、多环节的特点。

DA是NE的前体，二者关系密切。多巴胺功能亢进能提高攻击行为发生。DA有 D1、D2、D3、D4和D5 5种受体，均与攻击行为存在相关性，且D1、D2和D3受体的拮抗剂都能对实验动物的攻击行产生对抗作用。NE异常能引起的各种精神疾病，主要与分布于突触前膜NEα2受体有关。从其与DA的关系及其情志调节作用看，NE异常可能是愤怒的微观病理变化之一，肾上腺素能阻断药对去甲肾上腺素和攻击行为都具有降低作用。一般认为，应激主要通过HPA轴引起广泛的神经系统和激素的激活，且HPA释放的递质主要分为单胺类递质和肽类递质。因此，我们可以认为愤怒情绪应激能通过调节HPA轴功能或单胺类神经功能系统而引起单胺类神经递质发生异常变化，而经前平颗粒的纠正机制，可能是对单胺类神经递质及其受体直接作用及对HPA轴功能等间接调节综合作用的结果。

5-HT功能系统是引发攻击行为中至关重要的因素之一，5-HT、5-HT代谢产物及其受体等都与攻击行为的产生有着密切联系，前期研究［15］表明5-HTR2C是愤怒情绪反应大鼠模型大的密切相关基因，5-HTR2C受体是调肝方药的作用靶点。是但本研究中药物干预后，并未恢复正常水平，究其原因可能是5-HT系统与其它系统间存在相互影响，并且检测过程中也存在较多影响因素。Spielberger的“状态－特质”愤怒理论［16］，将愤怒体验视为:状态性愤怒(state anger)和特质性愤怒(trait anger)。这可能是对脑中枢中单胺类神经递质的变化无法形成统一认识的另一原因。因此，随着愤怒情绪研究的深入，将怒情绪致病微观机制的研究与状态－特质性愤怒的生物学机制的研究相结合，对更深层次研究怒情绪在心理问题与精神疾病中的作用，以及调肝方药的作用机制具有重要意义。

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