同型半胱氨酸引起平滑肌细胞LDLR启动子区DNA甲基化改变的位点分析

杨安宁，王 菊，杨晓玲，马长剑，孙炜炜，马胜超，王 磊，徐 华，姜怡邓

(宁夏医科大学1.基础医学院2.检验学院，宁夏银川 750004)

同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的独立危险因素［1］。前期研究发现:Hcy可引起低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)等AS相关基因发生甲基化改变［2］，但Hcy引起DNA甲基化的效应偏重于CpG二核苷酸序列还是CpG岛，即其甲基化作用位点尚不清楚。因此，本文以LDLR为研究对象，探讨Hcy引起平滑肌细胞LDLR发生甲基化改变的具体特点及机制，为进一步研究Hcy引起AS提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器和试剂 SZ-97自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂);全自动立式压力蒸汽灭菌器(上海申安YXQ-LS50A);高速低温离心机(Beckmancomlter AvantiJ-301，德国);相差显微镜(日本Nikon公司);凝胶成像系统和酶标仪(Biorad公司，美国);超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);CO2培养箱(Heraeus，德国);DNA甲基化修饰试剂盒(Epigentek，美国);DNA提取试剂盒(promega);胰蛋白酶和同型半胱氨酸(Sigma);限制性内切酶HpaII和BssHII(Fermentas);引物由上海生工公司合成。

1.2 人脐静脉VSMCs培养、鉴定及分组 按照Hua等［3］报道的方法，用组织块贴壁培养原代血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells，VMSCs)。选用第3代细胞用不同浓度 Hcy(50、100、200、500 μmol·L-1)刺激72 h，并以不加Hcy组为空白对照组(control)，进行后续实验。

1.3 巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)法检测LDLR甲基化改变 按DNA提取试剂盒说明书操作提取基因组DNA。用亚硫酸盐修饰法对其进行修饰。采用在线软件http://www.urogene.org/methprimer/设计引物，LDLR外引物:上游:5'-TTTGGGTAATTAGATGTGGATTTATG-3'，下 游:5'-ACAAAAAAACACTCCCTCTAAAAAA-3'，产 物 长 度412 bp。甲基化引物:上游:5'-TTTAGTAGTTGGA ATTGTAGGTATGC-3'，下游:5'-ACTTTAAAAAATA AACGAA-3'，产物长度151 bp;非甲基化引物:上游:5'-AGTAGTGGAATTGTAGGTATGTGT-3'，下 游:5'-CACTTTAAAAAACAAAAATAAACAAA-3'，产物长度149 bp。程序:94℃预变性5 min，然后进行降落式PCR，每循环降低 0.5℃，30 个循环(94℃，30 s;62℃，30 s;72℃，1 min)，72℃延伸7 min。琼脂糖凝胶电泳并分析光密度。按如下公式计算:甲基化%=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%。

1.4 甲基敏感性限制性内切酶法分析LDLR启动子区DNA甲基接受能力 甲基敏感性限制性内切酶HpaII(识别序列 CCGG)和 BssHII(识别序列CGCGCG)只酶切非甲基化序列，不酶切甲基化的CmCGG和CmGCGCG序列，经HpaII和BssHII消化后，破坏了未甲基化CG位点的结构，LDLR的DNA甲基接受能力下降，随后进行放射性分析DNA甲基接受能力。酶切反应体系:HpaII(2×104U·L-1)0.25 μl;BssHII(1 × 104U·L-1)0.5 μl;纯化的DNA 5 μg，混匀，4℃放置 24 h，然后用 E.Z.N.A 纯化试剂盒纯化。利用细菌SssI甲基转移酶催化DNA的CpG位点发生甲基化，以3H标记的S-腺苷甲硫氨酸(3H-SAM)为甲基供体，测到的放射性强度即为DNA甲基接受能力。

2 结果

2.1 VSMCs培养、鉴定 细胞培养5 d时，用相差显微镜观察见少量细胞从组织块周围爬出，呈梭形排列，放射状生长，培养2周后局部细胞平行排列，部分细胞多层重叠，高低起伏呈“峰、谷”状。α-肌动蛋白免疫细胞化学染色显示98%的细胞染色呈阳性，胞质呈棕黄色，胞核不着色，证实细胞为VSMCs，见 Fig 1，2。

Fig 1 VSMCs pictures under the Phase contrast microscope

Fig 2 VSMCs α-actin staining of immune cells(× 200)

2.2 Hcy对VSMCs中LDLR启动子区DNA甲基化修饰状态的影响 VSMCs经 50，100，200，500 μmol·L-1Hcy刺激后，LDLR启动子区DNA甲基化程度与对照组比较分别降低了9.82%、27.39%、22.18%和9.89%，以100 μmol·L-1组低甲基化程度最明显(P＜0.01)，见Fig 3。

2.3 Hcy对VSMCs内LDLR启动子区DNA甲基接受能力的影响 不同浓度Hcy刺激VSMCs 72 h后，增加了LDLR启动子区DNA甲基接受能力，经限制性内切酶HpaII消化后，LDLR启动子区C↓CGG序列被酶切，经限制性内切酶BssHII消化后，LDLR启动子区GC↓GCGC序列被酶切，与对照组比较，甲基接受能力下降，其中HpaII引起的效果更明显，见Fig 4。

Fig 3Hcy affected LDLR promoter DNA methylation of VMSCs(72 h)

3 讨论

近年来，Hcy对基因表达的影响受到广泛关注，而DNA甲基化是基因表达的重要调控方式之一［4］。LDLR作为与AS发生发展紧密相关的受体，其在Hcy诱导的平滑肌细胞增殖过程中的具体机制缺乏深入研究。

正常细胞基因组中70%的CpG二核苷酸序列是甲基化的，主要见于内含子、重复序列、潜在的活性转移成份等，甲基化状态使这些序列保持静默;而某些基因启动子区的CpG岛，特别是管家基因启动子区的CpG岛通常并不发生甲基化，才导致出现去甲基化的位点偏向于一般的CpG二核苷酸序列，而CpG岛所受影响较小［5-6］。本文通过甲基敏感性限制性内切酶法分析DNA甲基接受能力，观察到Hcy对平滑肌细胞LDLR启动子区DNA甲基化改变和位点的影响，Hcy引起LDLR去甲基化时，去甲基化位点可能偏向于原本已发生甲基化的CpG二核苷酸序列。DNA甲基敏感性限制性内切酶可以识别非甲基化的胞嘧啶序列(CG)，并有特异性的酶切作用，但对甲基化的CG没有作用。HpaII和BssHII对C↓CGG序列和CpG岛(GC↓GCGC)有特异性作用，经HpalI和BssHII消化后，未甲基化的CG位点结构被破坏，LDLR DNA甲基接受能力下降。同时，本实验结果还显示，VSMCs经不同浓度Hcy刺激后，使LDLR DNA甲基接受能力增加，推测主要是由于Hcy引起了其低甲基化，暴露出了更多的DNA甲基接受位点。Hcy处理后，经限制性内切酶HpalI和BssHII消化，LDLR DNA甲基接受能力下降，且以BssHII酶切引起的下降更明显，提示CpG岛原有的甲基化程度低于一般CG序列，导致更多的GC↓GCGC被酶切，表明Hcy引起LDLR DNA低甲基化更倾向于HpaII切点，即Hcy引起基因组去甲基化主要在C↓CGG序列而不是GC↓GCGC。因此，Hcy可使平滑肌细胞LDLR启动子区DNA发生去甲基化的效应偏重发生于一般的CpG二核苷酸序列，CpG岛所受影响相对较小。

1:Control;2:Control+H;3:Hcy(50);4:Hcy(50)+H;5:Hcy(100);6:Hcy(100)+H;7:Hcy(200);8:Hcy(200)+H;9:Hcy(500);10:Hcy(500)+H*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Fig 4 Changes of LDLR DNA methylation capacity by Hpall(A)and BssHII(B)processed

本研究结果同时显示，Hcy引起LDLR去甲基化并不呈剂量依赖关系，引起DNA甲基化程度变化最明显的是100 μmol·L-1Hcy组。这一结果在我们前期研究的Hcy引起VSMCs增殖的实验中，皆显示出100 μmol·L-1Hcy对甲基化的影响最明显;Li等［7］在研究 Hcy引起平滑肌细胞 IGF2和 CTCF DNA甲基化时，其引起DNA甲基化的Hcy最佳浓度为100 μmol·L-1;Jamaluddin 等［8］在研究 Hcy 引起内皮细胞损伤中也观察到cylinA DNA甲基化改变的最佳浓度为100 μmol·L-1，提示这一效应并非实验偶然因素所致，但为何无量-效关系，我们尚无确切的解释，一个推测是高Hcy可通过多种机制致病，Hcy 浓度在 100 μmol·L-1左右时，显示出较明显的对DNA甲基化修饰的干扰，浓度进一步升高后，其促进氧化应激、细胞凋亡、炎症反应等机制可能对细胞造成更严重的伤害，从而掩盖其对DNA甲基化修饰的影响。

本实验通过检测Hcy引起的平滑肌细胞LDLR甲基化及甲基接受能力的变化，分析了LDLR发生甲基化改变的可能机制及特点，为进一步阐明DNA甲基化在AS疾病中的调控机制提供理论依据。

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