不同炮制方法对黄连主成分含量及抗菌活性的影响

王 荣

湖南省临武县人民医院药剂科，湖南 临武 424300

黄连是临床常用的药材，据来源不同分为“味连”、“雅连”、“云连”等，主产于四川、云南、湖北等地。其始载于《神农本草经》，列为上品，具有清热燥湿、泻火解毒之功效。现代研究表明其有抗菌作用，且抗菌谱广，常用于解热镇痛、抗肠道细菌感染。

经不同方法炮制黄连后，其成分会发生不同程度的变化，可导致药性及功能主治的改变[1-2]。黄连的炮制种类繁多，其中酒黄连、姜黄连、萸黄连一直沿用至今，亦为药典收录。有学者以甲醇、乙醇等有机溶剂为提取溶剂对黄连不同炮制品提取物进行研究[3]，结合临床实际均是采用水煎剂入药。因此，本文选择黄连中小檗碱为主要有效成分代表，检测黄连不同炮制品水煎剂中小檗碱主要含量的变化[4-5]。不同炮制品的功效差异除与其有效成分有关，更与其抗菌活性密切相关[6]。本文研究了黄连不同炮制品中主要成分盐酸小檗碱含量的变化，及其对常见菌株抗菌活性的影响，为其临床应用提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1100，美国安捷伦公司）；超声波清洗器（KQ 3000，昆山市超声波仪器厂）；电子分析天平（BP211D，德国赛多利斯）；粉碎机（FW200，瑞安市永历制药机械有限公司）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100715-200821）；黄连药材（四川产，购于长沙中药饮片厂），经鉴定为毛茛科植物黄连Coptis chinensis Franch.；流动相所用甲醇、乙腈均为色谱纯（美国Fisher公司），水为纯化水。乙醇（广州化学试剂厂，分析纯），盐酸（汕头市光华化学厂，分析纯）。

金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、乙型溶血链球菌、沙门氏菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌由临武县人民医院检验科提供。培养基有两种处方，葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉浸出粉0.5%、葡萄糖1%、蛋白胨2%、酚红0.002%、氯化钠0.5%、pH 7.4～7.6；固体培养基为营养琼脂培养基：牛肉膏0.3%、琼脂 2%、蛋白胨 1%、氯化钠 0.5%、pH 7.2～7.4。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液 （用磷酸调pH为3.0，27∶73）；柱温：30℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：345 nm，理论塔板数在3000以上。

2.1.2 供试溶液的制备

2.1.2.1 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，用甲醇制成每毫升含0.01 mg的溶液，摇匀，即为对照品溶液。

2.1.2.2 供试品溶液制备 取醇提干膏0.05 g，加盐酸-乙醇溶液（1∶100）100 ml，超声提取，滤过，取续滤液，定容，即为供试品溶液。

2.1.2.3 阴性对照溶液制备 按对照品溶液制备方法，除去盐酸小檗碱，制备阴性对照溶液。

以上溶液按“2.1.1”项下色谱条件进样，所得图谱见图1。

2.1.3 方法学考察

2.1.3.1 线性关系考察 精密称取对照品溶液，加甲醇稀释成2.152 mg/ml的溶液，精密吸取对照品溶液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀。各取20 μl按上述色谱条件测定。以对照品峰面积为纵坐标Y，对照品进样量（μg）为横坐标X，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=19675506.0322X+15353.6178，r=0.9994，表明盐酸小檗碱在0.1076～4.3040 μg范围内线性关系良好。

2.1.3.2 精密度试验 分别精密吸取同一对照品溶液1 μl，连续进样5次，求得盐酸小檗碱对照品峰面积的RSD=6.2%。另外，于同一天不同时间分别进样测定，求得日内RSD=4.56%（n=5）；于不同的5 d同一时间连续测定求得日间含量RSD=1.68%（n=5），表明仪器精密度良好。

图1 黄连药材HPLC图谱

2.1.3.3 稳定性试验 按照“2.1.2.2”项下方法操作，考察同一供试品溶液放置0、2、5、10、24 h后盐酸小檗碱含量的变化，结果显示，其含量RSD=0.51%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.3.4 重复性试验 按照“2.1.2.2”项下方法操作，对同一样品依法测定6次，进样测定盐酸小檗碱的含量，结果RSD=1.18%，表明本法重复性良好。

2.1.3.5 加样回收率试验 精密移取盐酸小檗碱对照品溶液，加甲醇制成5.38 mg/ml对照品溶液，分别精密吸取上述溶液0.8、1.0、1.2 ml，按低、中、高 3 个量级溶液，定容，过滤，同一量级平行操作2份，计算回收率，结果盐酸小檗碱的平均加样回收率为 98.6%，RSD=1.2%（n=5）。

2.2 黄连不同炮制品的制备

2.2.1 生黄连

取黄连原药材（成簇者掰开），除去泥沙等杂质，抢水洗净略润，切薄片，阴凉处干燥。

2.2.2 酒黄连

取黄连片100 g，加入黄酒12.5 g拌匀，稍闷润，待酒被吸尽后，用文火加热，炒至表面色变深时，取出，摊凉，筛去碎屑。

2.2.3 萸黄连

取吴茱萸10 g，加适量水煎煮，取汁去渣，煎液与净黄连100 g拌匀，稍闷润，待药液被吸尽后，用文火加热，炒干，取出，摊凉，筛去碎屑。

2.2.4 姜黄连

取黄连片100 g，用生姜12.5 g或干姜4 g，绞汁或煎汁，取姜汁拌匀，稍闷润，待姜汁被吸尽后，用文火加热炒，炒至表面色变深时，取出，摊凉，筛去碎屑。

2.3 供试品溶液的制备

分别称取生黄连和3种黄连炮制品20 g，经粉碎成粗粉备用。称取粗粉10 g，加纯化水100 ml浸泡0.5 h，先以武火加热，直至煮沸，改以文火加热，继续再煎煮0.5 h。煎煮液以4层纱布过滤，收集滤液备用。滤渣加纯化水100 ml，重复加热、煎煮提取0.5 h，并过滤，收集滤液。合并2次滤液，水浴浓缩，直至浓缩至20 ml，收集生黄连和3种黄连炮制品浓缩液，相当于含生药0.5 g/ml。精密移取4种浓缩液各2.5 ml，分别加入95%乙醇7.5 ml，搅拌均匀，静置12 h，倾取药液上层液，得水提醇沉液，取适量20000 r/min高速离心20 min。取离心液上层清液，将上清液稀释100倍，相当含生药1.25mg/ml，制得样品溶液，备用。

2.4 黄连不同炮制品水煎剂中小檗碱的含量测定

分别精密吸取生黄连和3种黄连炮制品样品溶液各10 μl注入液相色谱仪，按照上述色谱条件测定，计算样品溶液中盐酸小檗碱含量，测定结果见表1。结果显示各样品中小檗碱含量排序为：姜黄连＞酒黄连＞萸黄连＞生黄连，其中姜黄连、酒黄连中盐酸小檗碱的含量明显高于萸黄连，而生黄连的含量则最低。

表1 黄连生品及其不同炮制品中盐酸小檗碱含量测定结果（mg）

2.5 黄连不同炮制品水煎剂的抑菌实验

培养基按配方比例煮沸溶解于蒸馏水中，调pH值后，在121℃高压灭菌15 min，冷却到45～50℃后以无菌方式分装备用。采用混合法进行，将各炮制品水煎液的原液，分别用无菌蒸馏水作等倍稀释（1/2～1/32），加入双倍营养琼脂混合，倾注成平板。将活化后的菌种接种于固体培养基上，分别挑选菌龄12～16 h、浓度80万/ml的实验菌液接种，在箱培养37℃温度下培养。恒温培养24 h，显微镜观察各细菌在不同药物浓度中生长情况，如果观察到不生长的药物时的浓度，即记录为该药液的最低抑菌浓度（MIC）。黄连不同炮制品的抑菌作用，以该药物的最低抑菌浓度来衡量其对常见细菌的体外抑菌效果。见表2。

表2 黄连及其不同炮制品对不同菌株的最低抑菌浓度（g/ml）

由表2可知，不同炮制品中酒黄连平均MIC最低，为0.23 g/ml，生黄连最高，为0.40 g/ml。抗菌实验结果表明，生黄连及其不同炮制品对不同细菌显示了不同的抗菌特性。提示，黄连不同炮制品的水煎液对上述各菌株均有不同程度的抑制作用。

3 讨论

黄连及其炮制品中生物碱类化学成分复杂，在研究过程中，笔者考察了流动相的pH、流速的变化、柱温的变化及样品不同制备方法、溶剂用量、不同提取时间。根据上述试验结果，确定了本研究中样品处理条件及色谱条件。本法简便易行、准确灵敏，重复性好，使用范围广，可用于检验、评价生黄连及其不同炮制品。

实验结果表明黄连经炮制后，其总生物碱的含量以盐酸小檗碱计，由强及弱的顺序为：姜黄连＞酒黄连＞萸黄连＞生黄连。但从总体来说，各类型炮制品中盐酸小檗碱含量要大于生品，因此炮制对黄连中主要成分的含量有一定的影响。

黄连为大苦大寒之品，服用日久易败胃，临床中治疗痈疽肿毒常用生品，而治疗痢疾和腹泻则常用其炮制品，以防止其寒性太过。黄连中主要有效成分为小檗碱，其具有较强的抑菌作用。实验结果显示，不同炮制品和生品相比也都有一定程度的抑菌作用，但炮制品的抗菌作用稍强。本实验欲探讨黄酒、吴茱萸和生姜对黄连抗菌作用机制的影响，实验结果证明黄连炮制后具有明显的抑菌作用，不同炮制方法对黄连的抗菌作用产生了较大的影响，经炮制后黄连不但抑菌活性有不同程度的增强，且减弱其对肠胃道的不良作用，本研究为临床应用提供了科学依据，并为进一步的研究打下坚实基础。

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[4]邹红,梅静,许腊英.不同炮制工艺对黄连中盐酸小檗碱含量的影响[J].湖北中医学院学报,2008,10(1):36-38.

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