扁平苔藓中早期生长反应因子-1和肿瘤坏死因子-α的表达及意义

邓磷君，白 莉

山西医科大学第一医院皮肤科，山西太原 030001

扁平苔藓（lichen planus，LP）是一种慢性炎症性疾病，累及皮肤黏膜，发病机制尚无定论。近年来研究发现细胞凋亡在其发病中有着重要作用。有学者认为肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在扁平苔藓角质形成细胞凋亡中发挥了重要作用，国内外研究表明，早期生长反应因子-1（Egr-1）可以上调TNF-α的表达[1-2]。本研究通过检测Egr-1、TNF-α在扁平苔藓皮损处的表达，探讨它们在扁平苔藓发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取在我院皮肤科就诊的30例患者，均经临床和病理确诊为扁平苔藓，其中，男18例，女12例；年龄15～70岁，平均41.5岁；半年内未使用过激素、免疫调节剂治疗。对照组30例均为我院整形科和普外科的正常人，其中，男16例，女14例；年龄22～69岁，平均44岁；无任何皮肤病及系统性疾病。两组性别和年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有皮损和正常皮肤组织均经甲醛固定石蜡包埋备用。

本课题已经伦理委员会讨论通过，且所有患者自愿签署了知情同意书。知情同意书内容主要包括：本课题研究时间为2010年6月～2011年3月；对患者的隐私进行保密；本实验的研究目的为进一步探讨参与LP的发病原因，为治疗该疾病提供有效依据；如患者受到因本实验导致的损失，笔者则加以赔偿；患者在了解上述内容后自愿填写同意书。

1.2 试剂

TUNEL原位凋亡检测试剂盒及二步法PV-6001 免疫组织化学检测试剂盒购自北京中杉生物技术公司；兔抗人Egr-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术公司；兔抗人TNF-α多克隆抗体由武汉博士德生物技术公司提供。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL原位凋亡检测法 石蜡标本连续切片；37℃烘烤过夜；常规二甲苯脱蜡；梯度酒精水化；蒸馏水冲洗，加3%的H2O2灭活内源性过氧化物酶，20μg/ml蛋白酶K37℃修复15 min，滴加TdT及FITC标记的核苷酸混合反应液37℃ 75 min，后滴加转换剂POD液37℃30 min，DAB显色，苏木素复染，封片。用不含TdT酶，只含标记dUTP的溶液代替TUNEL反应液作为阴性对照。

1.3.2 免疫组织化学法 采用PV6001 二步法：石蜡标本连续切片；常规二甲苯脱蜡；梯度酒精水化；蒸馏水冲洗，加3%的H2O2灭活内源性过氧化物酶；在枸橼酸钠缓冲液中高压加热（Egr-1 加热 2 min，TNF-α 加热 30 s）进行抗原修复；滴加一抗（Egr-1 浓缩液 1∶300 稀释，TNF-α 浓缩液 1∶200 稀释）；以PBS代替一抗作为阴性对照，37℃孵育 1 h；滴加二抗PV6001，37℃孵育 15 min，DAB 显色；苏木素复染，封片。

1.4 结果判定

TUNEL原位凋亡检测结果以显微镜下细胞核有棕黄色颗粒为阳性。免疫组织化学结果以细胞浆和（或）细胞核有棕黄色颗粒为阳性，每张切片随机选取5个视野，利用MIAS-2000 图像分析系统分析阳性区域积分光密度值（IOD值），以IOD值的大小代表阳性产物表达的多少。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0 统计软件进行分析，计量资料数据均以均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用成组t检验，指标间相关性采用Pearson相关分析，P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL检测结果

LP皮损表皮中大量角质形成细胞 （尤以液化变性的基底细胞层为多）和真皮浅层浸润的淋巴细胞呈阳性染色；而正常皮肤组织中仅有个别细胞出现凋亡；阴性对照中未见阳性结果。

2.2 免疫组织化学检测结果

LP皮损中Egr-1 的阳性表达重要分布于表皮全层的角质形成细胞和真皮浅层浸润的淋巴细胞核和胞浆中（以胞核为主），TNF-α阳性表达分布于相同部位的细胞浆中；而在正常皮肤组织中均呈阴性或弱阳性表达。两者在扁平苔藓组和对照组中的表达差异有统计学意义 （Egr-1：t=6.410，P<0.05；TNF-α：t=7.585，P<0.05），扁平苔藓组中 Egr-1 和 TNF-α的表达水平呈正相关（r=0.896 7，P<0.05）。见表1。

表1 早期生长反应因子-1、肿瘤坏死因子-α在扁平苔藓和正常皮肤组织中的表达水平（±s，μg/L）

表1 早期生长反应因子-1、肿瘤坏死因子-α在扁平苔藓和正常皮肤组织中的表达水平（±s，μg/L）

注：与对照组比较，*P<0.05

扁平苔藓组对照组组别例数30 30 Egr-1 11.296 ±3.316*7.076 ±1.343 TNF-α 12.996 ±3.761*7.399 ±1.482

3 讨论

LP是一种慢性皮肤黏膜疾病，至今发病机制尚未明确。细胞凋亡在LP发病中有着十分重要的作用。多项研究指出淋巴细胞参与介导的角质形成细胞过度凋亡可能是导致LP发病的重要机制，且其皮损中的胶样小体即为凋亡小体[3]。本研究结果显示，LP皮损处凋亡细胞数明显高于正常皮肤组织，证明了细胞凋亡的异常在LP发病中的作用有着十分重要的意义。本实验中凋亡细胞主要分布于表皮基底层和真皮浅层，且在相同部位检测到Egr-1、TNF-α大量表达，表明Egr-1 和TNF-α可能是通过介导细胞凋亡的发生参与LP的发病。

Egr-1 是含有3个锌指结构的转录因子，是即刻反应基因（immediate-early gene）的产物[4]。其基因广泛存在于从酵母到人类的真核细胞基因库中，参与调节多种细胞因子的基因表达。当细胞受到应激、炎症等细胞外刺激而引起膜去极化时，原本处于休眠状态的即刻反应基因通过丝裂原激活蛋白激酶（MAPKs）转导通路被激活[5]，转导合成Egr-1 蛋白。 有研究表明，多种细胞因子的编码基因启动子中都存在着功能性Egr-1 的结合位点，包括增殖分化、细胞凋亡、炎症因子趋化等相关基因[6]。Egr-1 通过与基因启动子上的位点结合，可调控相关细胞因子的表达，参与相应生物学作用的发生。本研究实验结果显示，Egr-1 在LP中的表达明显高于正常皮肤组织，这与刘丽等[7]的研究结果相一致，由此推测Egr-1 的高表达可能参与LP的发病。

皮肤中的TNF-α是由单核巨噬细胞、激活的T淋巴细胞和角质形成细胞产生的细胞因子，不仅参与免疫应答和炎症反应，还可介导细胞凋亡的发生。本研究结果显示，LP皮损中TNF-α表达明显高于正常皮肤组，这与王娟等[8]的研究结果一致，表明TNF-α在基底层和真皮浅层的高表达可能参与了LP的发病。LP皮损中CD8+T细胞占真皮浅层浸润的淋巴细胞的绝大多数，其可在局部释放细胞因子，通过死亡受体和穿孔素途径介导角质形成细胞凋亡。目前研究表明，死亡受体途径可能通过T淋巴细胞分泌的TNF-α、FasL与角质形成细胞表面的TNFR、Fas相结合，激活Caspase酶系的级联反应[9]，从而诱导角质形成细胞凋亡。

近年来有研究表明，Egr-1 可以上调TNF-α的表达水平[1]。本研究结果提示，Egr-1 与TNF-α的表达呈正相关，再次证明Egr-1 对TNF-α表达可能有促进作用。因细胞受到胞外刺激而转录合成的Egr-1 可能与TNF-α编码基因启动子上的位点结合，上调了TNF-α的表达水平。有学者通过利用Egr-1 反义寡核苷酸（AS-ODN）抑制Egr-1 的表达，观察到大鼠缺氧心肌细胞TNF-α表达明显减少，证明了Egr-1对TNF-α的可能的诱导作用[2]。

因此笔者认为，Egr-1 可能通过上调TNF-α的表达，经由CD8+T细胞介导角质形成细胞凋亡，从而参与了LP的发病。

[1] 郭晓林，姜雅秋，迟保荣.EGR-1 在重症胰腺炎中的作用[J].中国老年医学杂志,2008,3(28):215-216.

[2] 高萍.Egr-1 反义寡核苷酸对大鼠心肌细胞Egr-1 蛋白表达及缺氧/修复损伤的影响[D].汕头:汕头大学出版社,2006.

[3] Weedon D.Civatte bodies and apoptosis[J].Br J Dermato,1974,91(3):357.

[4] Khachigian LM.Early growth response-1 in cardiovascular pathbiology[J].Circ Res,2006,98(2):186-191.

[5] 崔文,孔灵玲,肖兰,等.乳腺癌耐药性中MAPK信号转导通路与EGR-1 关系的研究[J].济宁医学院学报,2009,32(1):1-3.

[6] Blaschke F， Bruemmer D， Law RE.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis[J].Rev Endocr Metab Disord,2004,5(3):249-254.

[7] 刘丽，臧磊，吕晓丹,等.Egr-1 在口腔扁平苔藓及口腔鳞状细胞癌中的表达及意义[J].宁夏医科大学学报,2010,32(2):204-206.

[8] 王娟，白莉.扁平苔藓中TNF-α和TNFRⅠ的表达及意义[J].实用医杂志,2008,15(31):4342-4343.

[9] Sugerman PB，Savage NW，Walsh LJ，et al.The pathogenesis of oral lichen planus[J].Crit Rev Oral Bio Med,2002,13(4):350-365.