低剂量拓扑替康诱导肺癌脑转移HTB-56/DDP细胞株凋亡机制的研究

高文斌 郑真真 高 丰 韩传军 黄建辉 张晓晨 王武龙3 汪艾曼 王若雨 方今女

肺癌是世界范围内最常见的致死性肿瘤［1］。脑转移是肺癌治疗过程中面临的重大难题，不仅因其多发性，还因其严重影响患者的生存率和生活质量［2-3］。据统计，约15% ～20%的非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)在进展过程中会出现脑转移［4］。传统的脑转移治疗以放射治疗为主，随着化疗药物及化疗方案的不断改进，化疗在脑转移中的应用越来越广。拓扑替康(topotecan，TPT)是DNA拓扑异构酶Ⅰ类抑制剂，能抑制拓扑异构酶Ⅰ的活性而使得DNA断裂，抑制DNA的复制，杀伤肿瘤细胞［5］。基础研究表明TPT在血脑屏障通过率可以达到30%并对多种肿瘤具有作用［6-7］。本研究采用低剂量TPT作用于体外培养的耐顺铂肺腺癌细胞HTB-56/DDP，并进行观察，旨在探讨TPT治疗肺癌脑转移的机制。

材料与方法

一、实验材料

人耐顺铂肺腺癌细胞HTB-56/DDP，本实验室保存;拓扑替康是贵州汉方制药有限公司产品;Annexin V FITC Apoptosis Detection Kit、Z-IETD-FMK、Z-DEVD-FMK为BioVision公司的产品;DMEM购于Gibco公司，噻唑蓝购于sigma公司，小牛血清为四季青产品。

二、实验方法

1.细胞培养:人耐顺铂肺腺癌细胞HTB-56/DDP培养于青霉素105 IU/L、链霉素100 mg/L，37℃，5%CO2，饱和湿度条件下，含有10%小牛血清的DMEM培养基中。实验用的细胞均处于对数分裂期。

2.Caspase酶抑制剂对TPT作用实验分组:①对照组:空白对照;②TPT单药组(6.4μmol/L);③TPT与Z-IETD-FMK合用组;④TPT和DEVD-FMK合用组。至研究终点，倒置显微镜下观察形态后，应用MTT法酶联免疫分析仪测定其490 nm处吸光值。每个实验设5个副孔，实验重复3次。

3.Annexin-V FITC及PI双染测早期凋亡:对以上实验组处理8 h后，收集上述各组细胞0.25%胰酶消化，按照Annexin v-fict apoptosis detection kit说明书操作步骤，用流式细胞仪进行检测。

4.流式细胞法检测细胞周期:处理细胞24 h后，收集上述各组细胞0.25%胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，加入预冷的无水乙醇固定过夜，染色前离心除去乙醇，磷酸盐缓冲液洗2次，加入RNA酶和PI复合染液，于室温下避光染色30 min，用Elite ESP型流式细胞仪检测DNA含量，分析细胞周期的变化。

三、统计学分析

采用SPSS19.0统计软件处理，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、Caspase酶抑制剂对细胞凋亡的影响

实验结果见表1。经分析caspase-3抑制剂Z-IETD-FMK及caspase-8抑制剂Z-DEVD-FMK所在的实验组细胞存活率均高于单用TPT组，有显著统计学意义(P＜0.05)，但两组间差异无统计学意义。

二、Annexin-V FITC与PI双染测早期凋亡

实验结果显示经TPT处理12 h的细胞显微镜下未发现典型的凋亡形态，流式细胞仪下出现早期凋亡，凋亡率与对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。合用caspase-3抑制剂Z-IETD-FMK及caspase-8抑制剂Z-DEVD-FMK实验组早期凋亡出现时间延迟，并且凋亡比例1.50%、1.88%与对照组(1.27%)无统计学意义(P＞0.05)。结果如图1～4所示。

三、流式细胞法测周期

处理24 h倒置显微镜下观察部分细胞悬浮，细胞缩小形状不规则并且台盼蓝拒染。流式分析得S期细胞减少与对照组(40.7±3.2%)相比有统计学意义(P＜0.05);G1期细胞比例增高(P＜0.05)，G2期细胞比例下降但无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

图1 未加 TPT组

图2 TPT6.4μmol·L-1

图3 TPT加IETD-FMK

图4 TPT加DEVD-FMK

表1 Caspase酶抑制剂对HTB-56/DDP细胞株生存率影响的比较()Table 1 Comparison of the effect of caspase inhibitor on HTB-56/DDP cell strain survival ratios()

表1 Caspase酶抑制剂对HTB-56/DDP细胞株生存率影响的比较()Table 1 Comparison of the effect of caspase inhibitor on HTB-56/DDP cell strain survival ratios()

注:aTPT组与caspase抑制剂组组间比较，差异有统计学意义，P＜0.05

表2 各组对HTB-56/DDP细胞生长周期的影响()Table 2 The effect of the HTB-56/DDP cell growth cycle()

表2 各组对HTB-56/DDP细胞生长周期的影响()Table 2 The effect of the HTB-56/DDP cell growth cycle()

注:aTPT组与对照组相比有统计学意义，P＜0.05

分 组 G1% S% G2 19.4 ±1.045.8 ±1.0 45.8 ±1.0 16.1 ±3.2 TPT24h 64.1 ±2.5a 27.5 ±2.4a/M%对照组

讨 论

NSCLC患者因发生脑转移导致生存率和生活质量严重下降，需采取多种针对性的治疗措施。单发脑转移可作为手术和SRS的指征，具体采用何种方式要视肿瘤的部位，全身性疾病及患者的医疗条件决定。对于多发性转移，立体定向放射治疗(stereotactic radiosurgery，SRS)或者全脑放疗(whole blood recal cification time，WBRT)要单独或联合用于手术的辅助治疗，应视具体病例要具体分析。但是肺癌常伴发多发脑转移及颅外转移病灶，是治疗失败的常见原因。过去由于血脑屏障的顾虑化疗很少应用于肿瘤脑转移，事实上当肿瘤发生脑转移的时候血脑屏障已经发生损坏，药物部分可以通过，并且经过放射等治疗，血脑屏障破坏更严重。有学者指出是缺乏有效抗肿瘤药而不是血脑屏障本身阻碍了联合化疗在肿瘤脑转移中的应用［8-9］。随着化疗药物及化疗方案的不断改进，化疗在肿瘤脑转移中的应用越来越广，并陆续有将其应用于一线方案治疗肿瘤脑转移的报道［10-11］。

TPT是拓扑异构酶Ⅰ(TopoⅠ)抑制剂，可诱导DNA单链断裂从而破坏DNA的螺旋结构，进而结合到拓扑异构酶Ⅰ-DNA复合物上，从而阻止断裂的单链修复，致使DNA双链断裂，最终导致肿瘤细胞死亡。TPT现多用于化疗敏感、一线治疗失败的小细胞肺癌和晚期卵巢癌的二线化疗［12-13］。TPT单药在难治性或者复发性小细胞肺癌中有效率为10% ～40%［14-17］，而在高文斌等［18］治疗肺癌脑转移临床观察中发现TPT有效率为37.21%，临床获益率达81.4%，TPT在脑内发挥发抗肿瘤的作用与颅外相当。为探究其机制，本实验于体外观察了TPT对耐顺铂肺腺癌细胞HTB-56/DDP的杀伤作用。结果显示TPT对耐顺铂株依旧有细胞毒作用，并且由于TPT抑制TopoⅠ作用导致DNA链的断裂及合成停止致使S期细胞被不可逆的损伤，在我们试验中也证实S期细胞实验组与对照组相比明显降低，表明TPT能特异性杀伤S期细胞，使细胞生长停止于G1期。这不但引能起细胞死亡，而且还有放射增敏作用。

凋亡是细胞的程序性死亡，近年来一系列的研究表明凋亡是抗癌作用的可能机制之一，已成为研究的热点。Caspase酶活化是凋亡的关键性步骤［18］，Caspase全称为含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶。各种Caspase都富含半胱氨酸，它们被激活后，能够在靶蛋白的特异天冬氨酸残基部位进行切割，从而造成细胞凋亡。各种凋亡信号，如fas、化疗放疗等均先激活启动性Caspase，触发级联反应，再激活效应性Caspase作用于相应底物。近期研究表明caspase-3是Caspase家族最重要的成员，而caspase-8则处于上游，它的活化可以启动下游的 caspase-3的活化［19-20］。我们的实验采用caspase3、8抑制剂，应用MTT法及Annexin V-FITC染色法，发现TPT引起肺腺癌细胞HTB-56/DDP凋亡的机制与caspase3、8有序活化有关。caspase-3是抗肿瘤药诱导凋亡的共同通路，至于TPT激活caspase-8的具体通路还需进一步研究。

TPT骨髓反应较重，Ⅲ～Ⅳ度的白细胞下降占57.14% ～62.26%，Ⅲ～Ⅳ度血小板下降占42.86%～52.38%［21-22］，但是TPT能透过血脑屏障，对于颅内颅外病灶都有一定的临床有效率，因此本研究认为低剂量的TPT可能是逆转耐药或联合应用于有脑部转移的晚期肺癌的一个具有潜力的药物。

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