机械通气对大鼠肺组织SP-A表达的影响及氨溴索的干预作用研究

李冬艳 张新日 刘超峰

机械通气在提供有效呼吸支持的同时还可导致严重的并发症，即呼吸机所致肺损伤(ventilator induced lung injury，VILI)。已有研究表明，肺表面活性蛋白A(surfactant protein-A，SP-A)在急性肺损伤(acute lung injury，ALI)的发生发展中具有重要作用，但在VILI的发病中是否具有同样的作用目前尚不完全清楚［1-2］。本研究通过观察氨溴索对机械通气大鼠肺组织SP-A表达水平的影响，探讨SP-A在VILI发生过程中的作用机制，以及氨溴索对VILI的防治作用。

材料和方法

一、动物模型的制备

24只雄性健康Wistar大鼠(山西医科大学实验动物中心提供，清洁级)，体质量300～380 g，随机分为3组:①对照组:气管切开前5 d开始每天上午及切开前1 h经腹腔注入生理盐水4 ml/kg，未行机械通气;②机械通气组(mechanical ventilation group，MV组):通气前5 d开始每天上午及通气前1 h经腹腔注入生理盐水4 ml/kg，VT30 ml/kg;③氨溴索干预组(ambroxol pretreatment group，AMB组):通气前5 d开始每天上午及通气前1 h经腹腔注入氨溴索30 mg/kg，VT30 ml/kg。采用25%乌拉坦(4 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠后行气管切开。MV组与AMB组大鼠均与动物人工呼吸机(DH-150型，浙江大学医学仪器厂制造)相连接行机械通气。呼吸机参数设置为:I︰E:1︰3，FiO2:21%，RR:60次/min，通气时间为120 min。

二、标本收集

通气结束后经腹主动脉放血处死大鼠，取左肺行支气管肺泡灌洗术(4 ml×4次)，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)回收量不少于80%，BALF经单层纱布过滤，静置10 min后行瑞氏染色，光镜下行中性粒细胞(polymorphonuctear，PMN)计数;剩余BALF以3000 r/min离心10 min，取上清液－20℃冻存待测。在无菌状态下取右肺上叶置于EP管中，－70℃冰箱保存，用于反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测。取右肺下叶用中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，用于普通病理和免疫组织化学染色。

三、BALF蛋白含量的测定

采用考马斯亮蓝法(试剂盒购自南京建成生物工程研究所)测定BALF蛋白含量，操作步骤严格按照试剂盒说明进行。

四、肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达测定

采用RT-PCR法测定肺组织SP-A mRNA表达，方法如下:用TRIzol法提取肺组织总mRNA，以大鼠GAPDH作为内对照。大鼠SP-A及内参引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SP-A上游引物:5’-TAA GTG CTG CCC TCT GAC CT-3’;下游引物:5’-AGG AGC CAT ACA TGC CAA AC-3’;反应条件:94℃预变性2 min，94℃变性20 s，57℃复性30 s，72℃延伸30 s，共36个循环，扩增片段长度为246 bp。GAPDH 上游引物:5’-TGA ACG GGA AGC TCA CTG G-3’;下游引物:5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’;反应条件:94℃预变性 2 min，94℃变性 20 s，56℃复性 30 s，72℃延伸 30 s，共 36 个循环，扩增产物长度为307 bp。取PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳，用Bio-Rad凝胶成像系统扫描条带宽度，以目的基因光密度值与内参照光密度值的比值表示肺组织SP-A mRNA的相对表达量。

采用免疫组织化学染色方法(SABC法)测定肺组织SP-A蛋白表达，具体操作步骤参照试剂盒说明(试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司)。兔抗大鼠抗体工作浓度为1︰50，以PBS(磷酸盐缓冲液)代替一抗作阴性对照。结果判断:阳性染色为细胞浆呈棕黄色。在400倍光镜下对每张组织切片随机选取5个视野进行观察，采用BI-2000医学图像分析系统检测每个视野的光密度值，以上述5个视野的平均值作为该组大鼠肺组织SP-A蛋白表达的相对含量。

五、统计学处理

结 果

一、大鼠肺组织病理学变化

光镜下观察，对照组大鼠细支气管上皮和肺泡结构完整，肺泡间质正常，无明显炎症细胞浸润;MV组肺组织可见肺泡间质增厚，大量炎症细胞浸润，部分肺泡破裂融合，肺泡腔内有出血;AMB组肺组织可见肺间质轻度水肿，少量炎症细胞浸润。见图1～3。

图1 对照组大鼠肺组织(HE×400)

图2 MV组大鼠肺组织大量炎症 细胞浸润，肺泡间隔增厚，红细胞渗入肺泡腔(HE×400)

图3 AMB组大鼠肺组织少量炎症 细胞浸润，轻度肺间质水肿(HE×400)

二、BALF PMN计数及蛋白含量测定结果

各实验组大鼠BALF PMN计数和蛋白含量测定结果见表1。结果显示:MV组大鼠BALF PMN计数和蛋白含量均明显高于对照组和AMB组(P＜0.01);AMB组大鼠BALF PMN计数和蛋白含量与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 各实验组大鼠BALF PMN计数及蛋白含量测定()Table 1 The PMN counts and the protein level in BALF of rats()

表1 各实验组大鼠BALF PMN计数及蛋白含量测定()Table 1 The PMN counts and the protein level in BALF of rats()

注:a与对照组比较:P＜0.01;b与MV组比较:P＜0.01

三、肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达水平测定结果

各实验组大鼠肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达水平测定结果见表2和图4～7。结果显示，MV组大鼠肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达水平均明显低于对照组和AMB组(P值均＜0.01);AMB组大鼠肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达水平与对照组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各实验组大鼠肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达水平()Talbe 2 The expression of SP-AmRNA and SP-A in lung of rats()

表2 各实验组大鼠肺组织SP-A mRNA及其蛋白表达水平()Talbe 2 The expression of SP-AmRNA and SP-A in lung of rats()

注:a与对照组比较:P＜0.01;b与MV组比较:P＜0.01

组 别 例数 SP-A mRNA表达 SP-A 1.55 ± 0.14 0.33 ±0.02 MV 组 8 0.73 ± 0.77a 0.26 ±0.11a AMB 组 8 1.43 ±0.23b 0.31 ±0.01蛋白表达对照组8 b

图4 对照组大鼠细支气管上皮细胞SP-A蛋白表达(SABC×400)

图5 MV组大鼠细支气管上皮细胞SP-A蛋白表达(SABC×400)

图6 AMB组大鼠细支气管上皮细胞SP-A蛋白表达(SABC×400)

图7 各组大鼠肺组织SP-A mRNA表达水平(RT-PCR法)注:M:Marker 1:对照组;2:机械通气组;3:AMB干预组

讨 论

肺泡表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)是一种由糖类、脂类及蛋白质组成的混合物，具有多种生理功能及生物学效应。PS主要成分之一是肺表面活性蛋白A(surfactant protein A，SP-A)，约占肺表面活性蛋白(surfactant protein，SP)总量的50%，主要由Ⅱ型肺泡上皮细胞和细支气管非纤毛柱状上皮细胞分泌，对维持肺泡正常结构和功能具有重要作用［3-4］。研究表明，SP-A质和量的异常与许多肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、ALI、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARPS)、肺纤维化等的发生、发展密切相关，但SP-A在VILI的发病中是否具有同样的作用目前尚无定论。

本实验结果表明，大潮气量通气组大鼠肺间质明显水肿，部分肺泡破裂融合，肺组织内大量PMN浸润，BALF中蛋白含量明显升高，而肺内SP-A表达水平明显降低。其机制可能是:①大潮气量机械通气直接损伤Ⅱ型肺泡上皮细胞，使SP-A合成和分泌减少;②肺内PMN活化后释放的弹性蛋白酶不但可使Ⅱ型肺泡上皮细胞变性、坏死，还可直接降解SP-A，导致其含量下降［5］;③炎症因子如TNF-α等通过抑制核转录因子NF-κB的活性，使细胞内SP-A mRNA及其蛋白表达减少［6］;④过氧化物一方面通过阻止转录因子TTF1与SP-A调控区的DNA结合，使SP-A合成减少，另一方面又可与SP-A发生交联反应，使其蛋白构型发生改变，活性降低［7］。

研究显示，SP-A不但具有降低肺泡表面张力和维持肺内自身免疫的作用，还能对抗和清除炎症因子、过氧化物和蛋白水解酶，对肺组织具有一定保护作用，故SP-A质、量及功能的改变可加剧肺内炎症反应，从而形成恶性循环。因此，通过减少SP-A破坏，上调SP-A的表达，促进PS的合成，对VILI的防治应具有重要意义。

氨溴索是具有多种生物学效应的化痰剂。近年来研究表明，大剂量氨溴索对急性肺损伤有一定的保护作用［8-9］。其机制有三方面:①促进肺泡表面活性物质生成，降低肺泡表面张力;②减少过氧化物生成，减轻肺部氧化性损伤;③抑制炎症细胞在肺内聚集、活化和释放炎症因子，减轻过度炎症反应对肺组织的破坏作用。本实验结果显示，AMB组大鼠SP-A mRNA及蛋白表达水平明显高于MV组，说明大剂量氨溴索可通过直接或间接途径减少SP-A的破坏，促进SP-A表达从而减轻肺组织损伤，对VILI的发生发展具有一定的保护作用。

总之，SP-A是VILI的发生发展过程中的重要因素之一，氨溴索可通过减少SP-A的破坏，促进SP-A表达而减轻呼吸机所致肺组织损伤，对VILI的防治有积极作用。

1 Gunther A，Ruppert C，Schmidt R，et al.Surfactant alteration and replacement in acute respiratory distress syndrome［J］.Respir Res，2001，2(6):353-364.

2 张新日，杜永成，姜宏英，等.呼吸机致大鼠急性肺损伤的实验研究［J］.中华急诊医学杂志，2006，15(7):608-611.

3 Greene KE，Wright JR，Steinberg KP，et al.Serial changes in surfactant associated proteins in lung and serum before and after onset of ARDS［J］.Am J Respir Crit Care Med，1999，160(6):1843-1850.

4 Wheeler AP，Bernard GR.Acute lung injury and the acute respiratory distress syndrome:a clinical review［J］.Lancet，2007，369(9572):1553-1564.

5 Malle E，Furtmuller PG，Sattler W，et al.Myeloperoxidase:a target for new drug［J］.Brit J Pharm，2007，152(6):838-854.

6 Pryhuber GS，Khalak R，Zhao Q.Regulation of surfactant proteins A and B by TNF-alpha and phorbol ester independent of NF-kappa B［J］.Am J Physiol，1998，274(1):L289-L295.

7 Doyle IR.Nichoas TE.Bersten AD.Serum surfactant protein-A levels in patients with acute cardiogenic pulmonary edema and adult respiratory distress syndrome［J］.Am J Respir Crit Care Med，1995，152(1):307-317.

8 蔡洪流，朱 红，李立斌，等.大剂量盐酸氨溴索对大鼠内毒素性肺损伤保护作用的实验研究［J］.中国急救医学，2006，26(8):605-607.

9 Jang YY，Song JH，Shin YK，et al.Depressant effects of ambroxol and erdosteine on cytokine synthesis，granule enzyme release，and free radical production in rat alveolar macrophages activated by lipopolysaccharide［J］.Pharmacol Toxicol，2003，92(4):173-179.